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检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验 (ELISA) 。往 预先包被植物果糖磷肌酸(PCr)酶联免疫吸附测定试剂盒 抗体的包被微孔中,依 次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并洗涤。 用底物TMB显色,TMB在化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的 作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷肌酸(PCr)酶联免疫吸附测定试剂盒 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度 (OD 值) ,计算样品活性。
样品收集、处理及保存方法
1. 样本不能含叠氮钠 (NaN3) ,因为叠氮钠 (NaN3) 是辣根 化物酶 (HRP) 的剂。
2. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行。
3. 植物萃取液或其它相关样本:请1000 x g离心20分钟,取上清 即可检测。
4. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存
于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1. 酶标仪 (450nm)
2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
操作注意事项
1. 试剂盒保存在 2-8℃ ,使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶溶解 后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封 (低温干燥) 保 存。
3. 浓度为 0 的 S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明 书操作时样本已经稀释 5 倍,最终结果乘以 5 才是样本实际浓度。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
| 名称 | 96 孔配置 | 48 孔配置 | 备注 |
| 微孔酶标板 | 12 孔×8 条 | 12 孔×4 条 | 无 |
| 标准品 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 | 无 |
| 样本稀释液 | 6mL | 3mL | 无 |
| 检测抗体-HRP | 10mL | 5mL | 无 |
| 20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 |
| 底物 A | 6mL | 3mL | 无 |
| 底物 B | 6mL | 3mL | 无 |
| 终止液 | 6mL | 3mL | 无 |
| 封板膜 | 2 张 | 2 张 | 无 |
| 说明书 | 1 份 | 1 份 | 无 |
| 自封袋 | 1 个 | 1 个 | 无 |
注:标准品 (S0-S5) 浓度依次为:0,20,40,80,160,320 U/mL
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按 1:20 稀释,即 1 份的20×洗涤 缓冲液加 19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置 1min 后甩尽 孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板 5 次。
2. 自动洗板机:每孔注入洗液 350 μL,浸泡 1min,洗板 5 次。
1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自 封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μ L;
3. 样本孔先加待测样本 10 μL,再加 40 μL;空白孔不 加。
4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根化物酶 (HRP) 标记的检测抗体 100 μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅 或恒温箱温育 60min。
5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置 1min,甩去 洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板 5 次 (也可用洗板机洗板) 。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50 μL,37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入终止液 50 μL,15min 内,在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。
结果判断
绘制标准曲线:在 Excel 工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应 OD 值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样 本浓度值。
免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或实验,否则所 产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者 承担。
试剂盒性能
1. 准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值,大于等于
0.9900。
2. 灵敏度:检测浓度小于 0.1 U/mL。
3. 特:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性:板内、板间变异系数均小于 15%。
5. 贮藏:2-8℃ ,避光防潮保存。
