荧光假单胞菌探针发荧光定量PCR试剂盒说明书

产品及特点荧光假单胞菌是一种环境污染菌。对于人类是一种罕见的机会致病菌。可从伤口、痰、胸水、尿和血液中分离出来，也可从血库存在中分离出。可在冰箱储存的血液及血液制品中繁殖，而且自溶后释放内毒素。其内毒素的磷脂部分，可导致输血后不可逆的休克。因此快速灵敏检测荧光假单胞菌具有重要意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2.引物经过精心优化，专一性强，只扩增荧光假单胞菌，与其他微生物没有交叉反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

1.本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

规格及成分成分 包装

2×Probe qPCR MagicMix500μL ）

荧光 PCR 专用模板稀释液1mL

荧光假单胞菌探针法 qPCR

引物-探针混合液150μL ）

荧光假单胞菌探针法 qPCR 阳性

对照(1×10E7 拷贝/μL)50μL

使用手册1 份

运输及保存低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂样品 DNA。

使用方法一、稀释PCR 阳性对照（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

如果做定性实验，则此步可以跳过。如果做定量实验，则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，     只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1.标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2.用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

3.在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡 1 分钟，

得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照（上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是样品制备 PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管中的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为描述操作步骤，

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程温度时间

预变性95℃2min

qPCR 反应

（40 个循环）95℃15sec

55℃30sec（采集 FAM 通道的荧光信号）

72℃30sec

四、数据处理

12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品， 如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，

则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

 产品CAT#:BH5216-51

低温运输，-20℃保存