小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒说明书
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62次小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒说明书
【产品名称】
商品名称:小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒
【包装规格】50 次/盒
【产品及特点】
本公司开发小鼠细小病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒,它具有下列
特点:
1.即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。
2.引物根据小鼠细小病毒专一区设计,特异性高。
3.荧光定量 PCR 检测,比常规 PCR 更加灵敏。
4.一管式闭管操作,降低了交叉污染。
5.本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6.本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。
【规格及成分】
成分 编号 塑料盒包装
2×qPCR MagicMix 90408 500 μL (棕色管)
荧光 PCR 专用模板稀释液 180701 1 mL (黄盖)
小鼠细小病毒染料法 qPCR 引物混
合液
4yw-8195 100 μL (白盖)
小鼠细小病毒染料法 qPCR 阳性对
照(1×10E8 拷贝/μL)
60908-81950
pc
50 μL (黄盖)
使用手册 LZ4W-8195 1 份
【运输及保存】
低温运输、 -20℃保存, 有效期一年。
【自备试剂】
DNA 模板、 超纯水、 10×ROX (根据机型决定,具体见使用方法) 。
【使用方法】
一、 稀释 PCR 阳性对照 (以 10E2- 10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀
释度为例)
1.注意: 由于阳性对照浓度非常高, 因此下列稀释操作一定要在独立的
区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分) 。
2.标记 6 个离心管,分别为 7, 6, 5, 4, 3, 2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液(最好用带芯
枪头,下同) 。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1
分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上
步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放
冰上待用。
6.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5
号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。 放冰上
待用。
7.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。 放冰上待用。
二、 样品 DNA 的制备
8.如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制
备阳性对照),一个是 NC (样品制备阴性对照)。 可以用 10μL PCR 阳
性对照的 10000 倍稀释的 (稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL, 10μL
相当于 10 万拷贝,可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,
充分混匀,此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自
备 TE 溶液中,充分混匀,此为 10000 倍稀释液) 再加上一定量的水作
为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所
用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品
DNA。
9.用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提
取试剂盒兼容。
三、 设置 qPCR 反应 (20 μL 体系,在样品制备室进行)
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管, 其中
N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品, 1 个用于 PCR 阴性对照, 6 个
用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个
PCR 管, 其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品, 1 个用于 PCR 阴
性对照(用水做模板), 1 个用于 PCR 阳性对照(用 第 4 号阳性对照
稀释液, 浓度为 10E4 拷贝/μL) 。下面只描述定量分析的步骤,定性
分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个, 其余不变。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性
对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖
子储存好后最后加) :
成分
样品管
N+2 个
PCR 阴性
对照管
PCR 阳性
对照管
(2-7 管)
2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
小鼠细小病毒染料法 qPCR 引物混
合液
2 μL 2 μL 各 2 μL
自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 待测样品 cDNA 模板 6 μL - - 自备超纯水 - 6 - 第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释
液(2-7 号) - - 各 6μL (2
号样到
2 号管,3
号样到 3
号管 …)
注:仅 ABI7500、 7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照, 其他荧
光 PCR 仪 器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、
RotorGene3000、 RotorGene 6000 和 LightCycler480) 不需要使用
ROX, 则用水替代。
12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR (具体 PCR 参数可以根据仪
器不同而自行优化)。
过程 温度 时间
预变性 95℃ 5 min
PCR 反应
(40 个循环)
95℃ 15 sec
60℃ 1 min,(采集 SYBR 通道的荧光信号)
按仪器预设程序进行熔解曲线分析
四、 数据处理
13. 如果把本试剂盒用于定量检测, 则以阳性对照浓度的 log 值为横轴, 以
Ct 值为纵轴, 绘制标准曲线。 再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出
样品 cDNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须
大于或等于 35。 阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线, Ct 值应
该小于或等于 30。对待测样品, 如果其 Ct 大于或等于 35 则为阴性, 如
果小于或等于 30 则为 阳性。如果在 30-35 之间,可结合熔解曲线判断,若
样品的熔解温度与阳性对照相同,该样本判断为阳性,否则为阴性。 【关联产品】
小鼠细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒