用Tide Fluor 染料标记氨基修饰的寡核苷酸

以下方案已经过优化，可用于标记200μg（~6 A260 nm单位）的专有寡核苷酸。 您需要根据您的实验调整相应的实验步骤以达到实验的佳效果。 您的氨基改性OLIGO必须进行处理以去除快速反应并消耗染料SUCCINIMIDYL酯的氨。

1.准备Oligo溶液

1.1将氨基修饰的oligo（~200μg）溶解在四硼酸盐缓冲液（100μL，pH 8.5±0.5）中。

注1：寡核苷酸必须在5'末端用胺基合成。 参见Appenxidx 1纯化氨基修饰的寡核苷酸。

注2：避免使用含有伯胺的缓冲液，如Tris，因为它们与胺反应性化合物竞争结合。

2.准备染料溶液

2.1通过上下吸移将1mg染料SE溶解在100μLDMSO中（如果可能，> 10mg / mL）。 将小瓶侧面的溶液原液离心至小瓶底部。

注意：在开始缀合之前准备DMSO染料溶液。 染料溶液的长期储存可降低染料活性。 任何含有染料的溶液都应避光。 我们不建议您存储DMSO染料溶液以备将来使用。

3.运行共轭反应

3.1在搅拌或摇动（保持反应混合物避光）的同时向染料溶液（B，20-50μL）中加入寡聚物溶液（A，100μL）。

3.2在室温下在旋转器或振荡器上旋转或摇动反应混合物4-6小时。

注意：在第一个小时内每10分钟轻轻涡旋一下小瓶，以确保反应溶液保持充分混合。 不要剧烈混合，因为材料可能留在小瓶的两侧。 六小时后，应标记50-90％的胺修饰的寡核苷酸分子。 如果更方便的话，反应可以孵育过夜。 然而，在大多数情况下，过夜孵育不会导致更高的标记效率。

4.纯化染料 - 寡糖结合物

4.1通过乙醇沉淀标记的寡核苷酸进行初步纯化

4.1.1将20μL（一般十分之一反应溶液体积）的3M NaCl和300μL冷无水乙醇（通常为两个半反应溶液体积）加入反应小瓶中。

4.1.2充分混合溶液并将其置于-20℃下30分钟。

4.1.3将该溶液在微量离心机中以10,000至15,000×g离心30分钟。

注意：如果离心时间不够长，可能会导致样品丢失。

4.1.4小心取出上清液，用冷的70％乙醇冲洗沉淀1-3次并短暂干燥。

注意：一些未反应的标记试剂可能在反应过程中沉淀或可能粘在反应瓶的壁上。在离心之前，通过大量涡旋混合将该材料全部再溶解。重新溶解标记试剂可确保沉淀的寡核苷酸少被未反应的标记物污染。

4.2通过HPLC或凝胶电泳进行终纯化

使用Tide Fluor 染料标记肽

以下方案已经过优化，用于标记10 mg仅含有一个游离氨基的肽（MW~2000）。您需要根据您的实验，调整相应的步骤以达到佳的实验效果。

1.制备肽溶液（溶液A）

1.1将肽（~10 mg）溶解在DMF（~1 ml）中。

注1：肽必须用碱如三乙胺或碳酸钾中和。

注2：避免使用含有伯胺的缓冲液，如Tris，因为它们与胺反应性化合物竞争结合。

2.准备染料溶液（溶液B）

2.1通过上下吸移将5mg染料SE溶解在500μLDMF中（如果可能，> 10mg / mL）。

注意：在开始缀合之前准备DMF染料溶液。染料溶液的长期储存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都应避光。我们不建议您存储DMF染料溶液以备将来使用。

3.运行共轭反应

3.1向染料溶液（B，500μL）中加入肽溶液（A，1mL），搅拌或摇动（保持反应混合物不发光）。

3.2在室温下搅拌反应混合物4-6小时。

4.纯化染料 - 肽缀合物

4.1浓缩反应溶液并在C18柱上纯化，得到所需的缀合物。通过HPLC分析级分，合并> 97％纯度的级分并冻干。

注1：HPLC纯化条件：TEAB缓冲液（三乙基碳酸氢铵，0.25mmol，pH = 7.0-8.0）用作缓冲液A，乙腈用作缓冲液B. HPLC在60分钟内从0％B至30％B进行（流速：100毫升/分钟）。

注2：操作过程中避免强光。