超声波破碎仪大肠杆菌破碎小知识
时间:2023-05-10 阅读:443
细菌工程菌在细胞内的表达主要分为两种形式,一种是在强启动子条件下的高效表达,由于蛋白质的过度表达,导致蛋白质立即高效不折叠而发生不规则卷曲,以固体颗粒形式堆积在细胞间质中。这称为包涵体,另一种为间质内可溶性表达,即折叠正常,具有生物活性。一般来说,只要细菌正常破壁,就可以离心分离的形式分离包涵体和可溶性表达蛋白。
大肠杆菌用于提取表达外源蛋白,在超声波破碎仪使用前,用含1%triton-X-100的PBS悬浮,然后破碎是有效的。1%triton-X-100的作用仍然明显,对其他几种细菌也有同样的作用。例如链霉菌等。
1、之所以会产生气泡,是因为你的探针位置没有到位。超声波破碎机的探头必须靠近底部,约1cm(推荐距离底部0.5mm)。电力因机器而异,观察液面,虽然有变动,但请不要太激烈。
2、打碎3S10S,破碎20-30个循环观察效果。
3、还要注意探头的定位,如果听错了就要及时调整。另外,可以从菌浓度方面考虑。用超声波破碎时,请尝试增大体积,使振幅不超过60%。
试着超过4、8s停止8s,对部分菌体蛋白来说,常规方法不易退热,蛋白变性产生气泡,停止时间稍长为宜。这多见于包涵体形式的蛋白质。更换Branson超声波破碎机进行作业,由于耗电量少,可以适当缩短休眠时间。
二、几个需要注意的问题:
1、蛋白以包涵体形式表达,要求高破碎率,细胞碎片小,而另一蛋白以可溶形式表达,细胞碎片不能小。两种情况要求不同,但目的相同,均便于后期固液分离。
2、超声波中出现黑色沉淀物,说明超声波功率太强。3、超声时间过长,功率过高肯定会影响蛋白活性。
4、尽量防止泡沫的产生。