YIJI细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色试剂盒产品说明书

主要用途

YIJI细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色试剂是一种旨在使用偶联偶氮技术，在酸性环境和酒石酸存在的情况下， 呈现出紫红色沉淀现象，来分析细胞样本中抗酒石酸酸性磷酸酶表达的而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。主要适用于动物原生代或培养细胞尤其是骨髓细胞和破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测。可用于骨质细胞病理生理的研究的鉴定。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP）是一种在哺乳动物内表达的糖化单体金属蛋白酶，970多碱基，320多氨基酸，分子量为35kD。作为破骨细胞的标志，抗酒石酸酸性磷酸酶与破骨细胞调节的骨resorption活性和骨生成代谢有关。抗酒石酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通过蛋白酶裂解和还原后活化。在酸性环境下，催化磷酸酯键的水解，产生醇和释放磷酸。其特征性为酒石酸抗性而与其它酸性磷酸酶区别。抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨细胞（osteoclast）、活化的巨噬细胞、神经细胞以及怀孕期的猪内皮层子宫内膜（endometrium）高度表达。在网状内皮组织增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛细胞性白血病（hairy cell leukaemia）、戈谢病（Gaucher’s disease）、爱兹性脑病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨细胞瘤（osteoclastoma）、骨质疏松症（osteoporosis）和代谢性骨病等病人体内抗酒石酸酸性磷酸酶显著增高。基于底物萘酚AS-MX磷酸盐（naphthol AS-MX phosphate），在酸性环境和酒石酸（tartrate）存在的条件下，酸性磷酸酶催化其水解，释放出萘酚（naphthol-AS），进而与重氮盐耐晒红紫（Fast red violet）偶联，于是在酶的活动处形成不溶性紫红色沉淀的偶氮染料，由此证明抗酒石酸酸性磷酸酶活性。其反应体系为：

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI固着液（Reagent B）   毫升

YIJI反应液（Reagent C）  微升

YIJI染色液（Reagent D）   毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存YIJI反应液（Reagent C）和YIJI染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反复冻融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

甲基绿复染试剂盒（YJ40010）：用于常规染色后复染

1.5毫升离心管：用于配制染色工作液的容器

恒温培养箱：用于反应孵育

光学显微镜：用于细胞染色后观察分析

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的YIJI反应液（Reagent C）和YIJI染色液（Reagent D）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。然后移取xx毫升YIJI染色液（Reagent D）到1.5毫升离心管，加入xx微升YIJI反应液（Reagent C），充分混匀后，标记为YIJI染色工作液，室温下，置入暗室。然后进行下列操作：

操作一：细胞载玻片染色

一、样本固着处理

• 取出待测的细胞载玻片 
• 小心加上xx微升YIJI清理液（Reagent A）在载玻片上，铺满整个样品表面
• 小心移去载玻片上的YIJI清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升YIJI固着液（Reagent B），铺满整个样品表面
• 室温下，孵育2分钟
• 小心移去载玻片上的YIJI固着液（Reagent B）
• 小心加上xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗样品表面
• 小心移去载玻片上的YIJI清理液（Reagent A）
• 重复实验步骤7至8一次

二、样本染色处理

• 小心加上xx微升YIJI染色工作液，铺满整个载玻片样品表面
• 在37℃恒温培养箱孵育15分钟；或直至可见紫红色（注意：避免光照）
• 小心移去载玻片上的YIJI染色工作液
• 室温下，加上xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗样品表面
• 小心移去载玻片上的YIJI清理液（Reagent A）
• 样本复染处理（选择步骤）
  • 样本复染处理（甲基绿）
  • 放上盖玻片或封片
  • 即刻在一般光学显微镜下观察：阳性细胞呈现紫红色，背景黄色，核为绿色

操作二：24孔细胞培养板染色

一、样本固着处理

1．小心抽去24孔细胞培养板里的培养液

2．每孔加入xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面

3．小心抽去每孔里的YIJI清理液（Reagent A）

4．每孔加入xx微升YIJI固定液（Reagent B），覆盖整个生长表面

5．在室温下孵育2分钟

6．小心抽去YIJI固定液（Reagent B）

7．每孔加入xx微升YIJI清理液（Reagent A），清洗细胞表面

8．小心抽去YIJI清理液（Reagent A）

9．重复实验步骤7和8两次

二、样本染色处理

• 小心加入xx微升YIJI染色工作液，覆盖整个生长表面
• 在37℃恒温培养箱孵育15分钟；或直至可见紫红色（注意：避免光照）
• 小心抽去YIJI染色工作液
• 小心加入xx微升YIJI清理液（Reagent A）
• 室温下孵育2分钟
• 小心抽去YIJI清理液（Reagent A）

三、 样本复染处理（选择步骤）

• 样本复染处理（甲基绿）
• 小心加入xx微升YIJI清理液（Reagent A）
• 即刻在一般光学显微镜下观察：阳性细胞呈现紫红色，背景黄色，核为绿色

注意事项

• 本产品为50次操作（细胞载玻片）和25次（1个24孔板）操作
• 操作时，须带手套
• YIJI染色工作液配制后，即刻使用，不得超过1小时
• YIJI染色工作液根据需要配制，每毫升，可以染色5个样本
• 试剂溶液在样品表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满样品表面
• 细胞固定建议不要超过2分钟，以免酶活性降低
• 如果样品中酶活性较低，细胞染色可以延长至45分钟
• 细胞染色注意不要过度
• 直接封片处理，不要使用有机溶剂（乙醇、二甲苯等），否则会使染色褪色
• 细胞染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 
• 本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰