实时荧光定量PCR(quantitative PCR, qPCR)通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。目前它主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。下面对qPCR产物标记跟踪两种方式分述：
 

　　一、荧光染料法
 

　　在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
 

　　荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在zuì常用的SYBR GreenⅠ，EvaGreen、SolisGreen属于饱和荧光染料。非饱和荧光染料在浓度高的时候会对PCR过程产生抑制，所以在荧光定量实验时使用浓度稍低，染料不能占据DNA双链上的所有位置。当PCR随着温度上升，双链逐渐解链，染料会从已解开的单链上脱落，然后结合到临近的尚未解链的双链中去继续发荧光。这种染料重排导致在较小的温度变化内，虽然DNA双链的解链过程不同，但荧光值是几乎不变的，也就是说，其溶解曲线不能精确反应双链的解链情况。
 

　　所以，对于非饱和染料，其溶解曲线分辨率相对较低，只能区分特异性的产物，不能分辨单碱基的差异。饱和荧光染料在DNA双链中所有可结合位点内都会有染料分子存在，染料与DNA的结合呈饱和状态，随着温度上升，在双链解链、染料脱离过程中，未解链的双链部分不存在染料可以结合的位点，染料不能发生重排。所以使用饱和染料制作的溶解曲线分辨率很高，可以精确反映DNA双链随着温度的解链情况，精度可以达到单碱差异的区分。
 

　　二、荧光标记的探针法
 

　　PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团， 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时(在延伸阶段)，Taq 酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成wán全同步，这也是定量的基础所在。
 

　　染料法VS探针法：
 

　　1.探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，探针法能够用多重体系反应，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高
 

　　2.染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好。