紫外分光光度计的工作原理主要基于朗伯-比尔定律(Lambert-Beer Law)。
 

　　当一束紫外或可见光通过含有吸光物质的均匀溶液时，部分光会被溶液中的吸光物质所吸收，导致光强度减弱。

　　吸光物质对光的吸收程度与溶液中吸光物质的浓度、光通过溶液的路径长度(通常称为光程)以及吸光物质对特定波长光的吸收系数有关。
 

　　具体来说，入射光强度(I₀)与透过光强度(I)之间的关系可以用朗伯-比尔定律表示为：A = -log (I / I₀) = ε × c × l ，其中 A 为吸光度，ε 为摩尔吸光系数(与物质的性质及入射光波长有关)，c 为溶液中吸光物质的浓度，l 为光程。
 

　　在紫外分光光度计中，光源发出连续的紫外-可见光，经过单色器分光，得到特定波长的单色光，然后照射到装有样品溶液的比色皿中。检测器测量透过样品溶液后的光强度，并与入射光强度进行比较，从而计算出吸光度。
 

　　通过改变入射光的波长，并测量不同波长下的吸光度，就可以得到物质的吸收光谱。根据吸收光谱的特征峰位置和强度，可以对物质进行定性和定量分析。
 

　　例如，在测定蛋白质浓度时，由于蛋白质中的芳香族氨基酸在 280nm 波长处有特定的吸收，通过测量该波长下的吸光度，结合已知的摩尔吸光系数和光程，就可以计算出蛋白质的浓度。