活性氧检测试剂盒

使用说明书

活性氧检测试剂盒操作步骤：

一、试剂准备：

1. dcfh-da可稀释于培养基或缓冲液中。血清或培养基颜色并不影响dcfh-da及细胞内荧光产生，但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将dcfh-da稀释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如pbs中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。

2. 加入dcfh-da的时机或孵育时间，以zui终能顺利检测细胞内活性氧为目的。药物处理时间较短(<2小时)或预计ros效应较弱，可先加或同时加入dcfh-da。反之，treat 刺激时间较长(>6 小时)或预计产生ros效应较强，可后加dcfh-da。

3. 活性氧供体含高纯度12 mm h2o2。加入细胞后其本身即是一种活性氧，而且在代谢过程中可产生其它类型的活性氧，均可使dcfh-da氧化为dcf呈现强绿色荧光。因而，用户可使用该试剂作为测试实验系统或仪器的阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将该实际作为实验的一个阳性对照。*该试剂的细胞工作浓度为20~100 μm或更低浓度，但超过200μm将产生细胞毒。如果用户熟悉ros荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。

二、加入荧光探针：

1. 加入dcfh-da于培养基，*初始工作浓度为10 μm。对不同的细胞和处理，dcfh-da工作浓度可为100 nm~20 μm，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在1:500~1000以上以避免dmso对细胞的影响。以dmso作为溶剂对照。

2. 37 oc 孵育细胞30min~至几个小时，通常30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、dcfh-da浓度有关。

3. pbs洗涤细胞2次。

三、活性氧检测试剂盒荧光检测

采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每10分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细胞仪可将细胞

用*消化pbs洗涤后重悬检测。