凝胶迁移实验系列二-实验操作方法

1.探针的标记：
（1） 如下设置探针标记的反应体系：
待标记探针 （1.75pmol/微升）                        2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）       1微升
Nuclease-Free Water                                           5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）     1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升）       1微升
总体积                                                                      10微升
按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
（2） 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
（3） 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
（4） 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
（5） 标记好的探针立即使用，zui长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
2.探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：
（1） 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
（3） 在4℃，12000g-16000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
（4） 在4℃，12000g-16000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
（5） 加入100微升TE，*溶解沉淀。标记好的探针立即使用，zui长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存于-20℃。