荧光标记法检测细胞凋亡
时间:2012-07-16 阅读:1088
荧光标记法检测细胞凋亡
一、仪器与试剂
1. TdT酶(25U/μl);
2. *标记的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的dUTP (Digoxingening-11-dUTP)1nmol/μl;
3. 反应缓冲液;
4. 洗涤缓冲液;
5. 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的亲合素或链霉亲合素 (2.5μg/ml)或抗地高辛抗体(1:30);
6. PI染液(含PI 5μg/ml及0.1%无DNA酶活性的RNA酶);
7. PBS缓冲液;
8. 塑料盖玻片;
9. 贴壁生长的培养细胞;
10. 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片;冰冻切片;常规石蜡切片。
二、操作步骤
1. 固定:培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃冰箱)后,用80%酒精再固定2h(-20℃冰箱);常规4%中性福尔马林固定、石蜡切片进行脱蜡、水合;
2. 洗涤:将玻片浸入PBS缓冲液,摇床上洗涤5min,三次;
3. 反应:洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分,按50μl/cm2 滴加反应液(每50μl反应液含TdT酶0.5μl ,标记的-dUTP 1μl),使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h;
4. 终止反应:去掉塑料盖玻片,将玻片置于盛有洗涤缓冲液的染色缸内,洗涤2次,每次5min;
5. FITC标记:洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分,按50μl/cm2滴加FITC反应液(含FITC 2.5μg/ml),室温下避光孵育10min;
6. 洗涤:将玻片置于洗涤缓冲液内,洗2次,每次5min;
7. PI复染:将玻片置于盛有PI染液的染色缸内,室温下避光染色30min
8. 封片:用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上,亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘,置暗盒中,尽早镜检观察;
三、结果判断
用荧光显微镜观察,选用蓝色激发光(波长488nm),所有的细胞核均被PI着色,显示出红色荧光,而凋亡细胞被特异地标记上FITC,显示出黄绿色荧光。