【摘要】  目的 建立一种能用于*原料及制剂中有关物质控制的HPLC方法。方法 采用XBridge Shield RP18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温30℃，流动相为乙腈∶pH8.2磷酸盐缓冲液（0.05mol/L*溶液，用20%磷酸调节pH至8.2）（55∶45），流速1.0ml/min；检测波长210nm；样品溶液的进样量为200μg。结果 *与其杂质（氮杂*A，*A肟，N去甲基*，*德糖胺以及*N氧化物）能达到基线分离；盐酸、硫酸、乳糖酸、柠檬酸、马来酸等*注射剂中常用酸根对*有关物质的测定无影响；方法的线性、准确性、灵敏度以及粗放性均能满足要求。结论 本文所建方法能较好地反映国产各种*原料及制剂中的有关物质的情况，为国内市场上不同*注射剂的评价、*及其口服制剂的质量控制提供了较好的分析手段。

【关键词】  *； 有关物质； 原料； 制剂

RPHPLC determination of azithromycin and its related substances

    in durg substances and parenteral formulation

    Wang Mingjuan,  Xu Mingzhe,  Hu Changqin,  Wang Lixin  and  Wang Chen

    （National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,  Beijing 100050）

    ABSTRACT  Objective  To develop an HPLC method for determination the related substances of azithromycin in parenteral products.  Method  The separation was performed on a column of XBridge Shield RP18 （250mm×4.6mm, 5μm）, with acetonitrile∶pH8.2 phosphate buffer （0.05mol/L K2HPO4 solution, adjust pH to 8.2 with 20% phosphate acid） （55∶45） as the phase at flow rate of 1.0ml/min. The detection wavelength was 210 nm. The injection amounts of sample solutions were 200μg.  Result Azithromycin and its related substances, including azaerythromycin A, erythromycin A oxime, Ndemethylazithromycin, desosaminylazithromycin and azithromycin Noxide, can be well separated from each other on the developed system. The coexistence acids in azithromycin for injection e.g. HCl, H2SO4, lactobionic acid, maleic acid, citric acid, etc, did not interfere with the determination of the related substances. Linearity, accuracy, sensitivity and robustness of the method could meet the specific analytical requirements.  Conclusion Thedeveloped method can be successfully applied to the quality control of azithromycin drug substances and products.

    KEY WORDS  Azithromycin;  Related substances;  Drug substances;  Drug products

  
　 *为半合成碱性大环内酯类抗生素，由*A生成9肟衍生物后发生Bechman重排，再经还原及N甲基化而成。*在水中几乎不溶，在稀酸溶液中易溶；对酸较敏感，在酸溶液中可使**降解［1］。中国药典2005年版中收载有*及其口服制剂，国内新药试行标准涵盖了各类注射用*原料（盐酸*、硫酸*、乳糖酸*、马来酸*、**、**、*柠檬酸二氢钠）及相应的注射剂（粉针，小针剂及大输液）。对上述原料及制剂的科学性评价已势在必行。

    有关物质检查是目前药品安全性评价的一个重要指标。虽然利用TLC可以有效地控制*原料中的有关物质［1］，但HPLC法是zui常用的有关物质检查方法之一。采用HPLC法分析*有关物质存在以下难点：①与其它大环内酯类抗生素一样，*在紫外区仅具有末端吸收，限制了其检测灵敏度；②*属碱性物质，容易和色谱柱的硅醇基相互作用，导致色谱峰拖尾严重。中国药典2005年版以及国家食品药品管理局标准中对*原料及其制剂中“有关物质”的检查均采用薄层色谱法；国外药典则采用LC末端检测或电化学检测法检查*有关物质（表1）；另有文献报道［2］，即使采用偏碱性流动相，*及其杂质在普通C18柱或铝基质色谱柱（USP中的L29色谱柱）中仍拖尾严重。新型的杂化颗粒色谱柱XTerra RP18能将*与其杂质较好的分离，该方法已被EP5.0版收载。

    本文参考国外药典［3～5］和文献［2］的色谱条件，以*及其主要杂质［氮杂*A（azaerythromycin A，EP中杂质A）、*A肟（erythromycin A oxime）、N去甲基*（Ndemethylazithromycin）、*德糖胺（desosaminylazithromycin）、*N氧化物（azithromycin Noxide），结构示意图见图1］的分离情况为指标，建立了一种易在国内普及、专属性较好的HPLC末端检测法。该法不仅能满足对*原料中有关物质的控制，且能较好的排除各种注射用*中各种酸根及其它辅料的干扰，并能满足对各类*输液相关物质检测的灵敏度。采用本方法分析*及各类注射剂中的有关物质含量，为*注射剂的评价提供了科学的 表1        国外药典中常用*有关物质检查方法的比较 数据。

    1  材料与方法

    1.1  仪器、试剂与样品

    岛津液相色谱系统：包括LC20AT型双泵，SIL20AC型自动进样器，SPDM 20A型PDA检测器；Waters液相色谱系统：包括1525型双泵，717plus型自动进样器以及2487型双通道紫外检测器。

    *、磷酸均为分析纯级（北京化学试剂厂），乙腈为色谱纯级（Fisher公司）。

    *对照品（批号060090QCS）以及氮杂*A、*A肟、N去甲基*、*德糖胺、*N氧化物等杂质对照品均由Pfizer公司提供；*原料（包括盐酸*、硫酸*、乳糖酸*、马来酸*、**、**、*柠檬酸二氢钠）及相应的注射剂（粉针，小针剂及大输液）均为从流通市场上抽验到的国内药厂产品。

    1.2  溶液的制备

    （1）对照品溶液  取*及其杂质对照品，分别精密称定，用乙腈∶水（60∶40）溶解并分别配制成约0.1mg/ml的溶液，用于有关物质峰定位以及方法学考察。分别精密量取1ml，混匀，作为混合对照品溶液。

    （2）样品溶液

    ①原料  精密称取适量，用乙腈∶水（60∶40）溶解（必要时先用乙腈助溶）并稀释成约10mg/ml（以*计）的溶液；

    ②粉针剂  采用整瓶稀释法，按标示量用乙腈∶水（60∶40）溶解并稀释成约10mg/ml的溶液；

    ③水针剂  取5支样品，混匀后，精密量取适量，用乙腈∶水（60∶40）稀释成约10mg/ml的溶液；

    ④大输液  直接进样测定。

    1.3  色谱条件

    色谱柱：XBridge Shield RP18柱（Waters公司），250mm×4.6mm，5μm；CAPCELL PAK C18UG120（资生堂），150mm×4.6mm，5μm；Apollo C18（Grace公司），250mm×4.6mm，5μm和XTerra MS C18，50mm×4.6mm，2.5μm；柱温30℃；乙腈∶pH8.2磷酸盐缓冲液（0.05mol/L*溶液，用20%磷酸调节pH至8.2）（55∶45）；流速1.0ml/min；检测波长210nm；进样量为20μl（大输液中由于*浓度很低，zui高为2mg/ml，故通过加大进样体积使总的进样量为200μg）。

    2  结果

    2.1  HPLC方法的确定

    以*和5种*杂质的分离情况为指标，调整流动相使得*与诸杂质能达到较好的分离，且保持较好的峰形（图2）。

    本色谱系统对色谱柱有一定的选择性。*及其杂质在杂化颗粒的C18柱（XBridgeTM Shield RP18和XTerra MS C18）和聚合物包被的C18柱（CAPCELL PAK C18 UG120）中峰形较好， 但在普通耐碱色谱柱*及其杂质混合图谱（Apollo C18）中峰形不理想，且内嵌极性基团的XBridge Shield RP18柱的选择性与其它C18柱不同，内嵌极性基团的存在有利于难分离物质对N去甲基*与*德糖胺的分离，建议采用硅胶表面经杂化处理的十八烷基键合硅胶色谱柱，如XBridge Shield RP18（250mm×4.6mm，5μm）或与之相当的色谱柱，系统适用性指标采用：①调节流动相比例，使*峰的保留时间约为11min，此时*N氧化物、N去甲基*、*德糖胺、氮杂*A和*A肟相对于*的保留时间分别为0.35、0.48、0.52、0.58和0.62，上述杂质相对于*的校正因子分别为0.62、0.70、1.66、0.77和2.94；②*峰的拖尾因子不得大于2.5；③*对照品溶液在100℃加热30min后，*与其相邻降解杂质峰的分离度应符合规定（图3B）。

    2.2  方法学考察

    按中国药典2005版附录XIXA［6］的相关规定，对所建方法的线性、定量限、检出限、精密性、粗放性和溶液的稳定性进行评价。上述方法检测*及其杂质的zui低检出限、zui低定量限、加样回收率及线性范围见表2。

    取混合对照品溶液200μl，连续进样5针，各物质峰面积的RSD均小于0.4%；取不同时间配制的*对照品溶液进样，其响应值的RSD小于0.5%（n=3）；说明方法的精密性良好。采用岛津或者Waters液相色谱系统分析*原料及其制剂中的有关物质，方法的灵敏度、专属性均能满足要求。 *：采用有关物质已知的注射用*，利用标准物质加入法（各杂质浓度分别约为0.08、0.10和0.12mg/ml，n=3），考察方法的回收率；

    **：以进样量200μg计算。冬氨酸、*、柠檬酸二氢钠等酸根对*有关物质分析的影响，结果表明上述酸根均在接近死体积的位置（RRT约为0.27）出峰，均不干扰有关物质的测定。

    *溶液对酸和热不稳定，在0.1mol/L盐酸中放置24h后主峰*消失（图3A），所形成的杂质经杂质对照品比对及LCMS确认（流动相同本法，但将乙腈∶磷酸盐缓冲液改为乙酸盐缓冲液）为其酸降解产物*德糖胺（EP中杂质J）；在100℃加热30min，杂质也有明显增加（图3B），但降解杂质均不干扰对相关物质的测定。

    2.3  对*原料及制剂中有关物质的分析

    在对国产*原料及诸制剂中的有关物质进行分析，发现①*葡萄糖或氯化钠输液中的杂质含量zui高；在所检测的90批样品中约96%的*输液中的杂质总量已超过5.0%，个别样品杂质总量高达46%；约30%的*葡萄糖输液和10%的*氯化钠输液的含量低于其标示量的90%；图4为*葡萄糖输液的典型图谱，该制剂中的zui大杂质为*的酸性降解产物*德糖胺。②各类注射用*原料（盐酸*、硫酸*、乳糖酸*、马来酸*、**、*柠檬酸二氢钠）及其注射剂（包括粉针剂、水针剂）中，杂质总量一般在0.9%～4.0%，但是仅注射用*/*注射液（助溶剂为柠檬酸钠）和注射用乳糖酸*的部分样品中的杂质总量能满足USP30版（2007年增补版）的要求（≤2.0%）。③上述样品中有关物质的含量与其成盐或作为助溶剂的酸的性质密切相关：盐酸*、硫酸*及用磷酸为助溶剂的*注射剂中的总杂质含量均超过3.0%，部分样品甚至高达10%～20%；采用柠檬酸等弱酸作为助溶剂的注射用*的杂质总量一般小于2.0%。通过比较*在不同酸中的稳定性：放置24h后，*在0.05mol/L硫酸中主峰消失，在0.1mol/L马来酸中主峰残留约20%，但在0.1mol/L柠檬酸或0.1mol/L乳糖酸中仅约20%的*发生了降解，提示*注射剂中的杂质主要来源于成盐/助溶阶段。④国产*原料中常见的zui大杂质为氮杂*A、N去甲基*或EP中的杂质B（RRT为1.26～1.29）（图5）；在所考察的14批原料中仅有14%的样品杂质总量未超过2.0%，提示国产*原料的质量有待进一步提高。

    3  讨论

    本文建立的易在国内普及、专属性较好的*有关物质HPLC分析方法，较好地解决了*有关物质分析的难题，为*及其口服制剂的质量控制，为科学评价不同酸成盐/作为助溶剂的各类*注射剂的产品质量均提供了良好的分析手段。

    对各种*注射剂的分析表明，*葡萄糖/氯化钠输液中的杂质含量zui高，这与*对酸敏感、对热不稳定的特性有关，因此，*输液剂型本身是否合理值得思考。

    注射用*及其水针剂的质量整体好于*输液，其杂质总量一般在0.9%～4.0%，但其杂质的含量与其成盐或作为助溶剂的酸的性质密切相关，盐酸*、硫酸*以及采用磷酸为助溶剂的*注射剂的杂质含量明显偏高，部分样品中的杂质总量高达10%～20%，提示科学评价国内市场上含不同酸根的*注射剂剂型的合理性势在必行。

【参考文献】
  　　［1］ Khedv A, Sheha M. Quantitative ThinLayer Chromatographic method of analysis of azithromycin in pure and capsule forms ［J］. J Chromatogr Sci,2003,41（1）:10～16.

［2］ Kamau F N, Chepkwony H K, Ngugi J K, et al. Isocratic liquid chromatographic method for the analysis of azithromycin and its structurally related substances in bulk samples ［J］. J Chromatogr Sci,2002,40（9）:529～533.

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［6］ 中国药典委员会. 中华人民共和国药典2005版（二部）［S］. 北京：化工出版社，2005.

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