荧光标记mRNA差异显示技术
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466次摘要 目的:应用荧光标记的mBNA差异显示技术。方法:提取未经过/经过IFN、LPS处理的三组人单核细胞系U937的总RNA并以此为模板,采用荧光标 记的锚定引物,通过逆转录、差异显示PCR反应,经5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带,回收后将其再扩增。结果:三组样本的 DD-PCR产物电泳显示长30 0 bp~2.0 kb不等的扩增片段,条带清晰、明亮,背景低,各样本相互间的差异不仅呈有无的变化,亦表现出很多强弱改变;再扩增条带锐利、单一。结论:在本试 验室成功应用了荧光标记差异显示技术,可快速、敏感、经济有效地筛选各种未知的表达基 因。
中图分类号: Q781文献标识码: B
文章编号:1000-6834(200 0)04-0373-04
FLUORESCENT mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY TECHNIQUE
WANG Gang-shi
(Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;)
WANG Meng-wei
(Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;)
YOU Wei-di
(Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;)
WANG Hong-fan g
( Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080)
FENG Mei-fu
( Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080)
ABSTRACT Aim: To apply fluorescent mRNA differential display technique.Met hods: Total RNA samples were extracted from human monocyte line U937 treat cd/untreated with IFN and LPS, and were used as templates in differential displa y PCR. The anchored primers used were labeled with the fluorescent tag. After ru nning on 5.6% denaturing PAGE gel, differentially expressed bands were excised a nd recovered, and finally reamplified. Results: Three tested samples all showed amplified bands differed from 300 bp to 2.0 kb, the bands were brigh t and clear, the background was low. Both yes/no changes and upregulated/downreg ulated happenings were shown simultaneously. The reamplification bands were shar p and pure. Conclusion: We have successfully practiced fluorescent differential display technique in our lab. It is a fast, safe and cost-effecti ve method used to sereen unknown expressed genes.
KEY WORDS: differential display; RNA; messenger ; fluorescence
mRNA差异显示技术(differential display,DD)是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年[1]]被报道后,即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。在应用过程中不断得到改进[2],并产生了诸多衍生技术如RPA(RNA finger printing by arbitrarily primed PCR)、GDD(genomic DD)等。本文简要介绍在本试验室荧 光标记差异显示技术(fluorescent DD,FDD)的应用及体会。
1 材料与方法
1.1 标本
人单核细胞系U937,细胞密度2×108/L,分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2),N用1640培养基及10%胎牛血清培养,T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7 h。
1.2 主要试剂与仪器
TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript Ⅱ逆转录酶(GIBCO BRL)、Ampli Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega);Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)
1.3 总RNA的制备
按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA,以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性,并以紫外分光光度计检 测其纯度
1.4 mRNA差异显示
1.4.1 逆转录反应 选择锚定引物[T7(dT12)AP(anchored prime rs,AP),序列为5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′,其中 M=A/G/C. N=A /G/C/T],以总RNA为模板进行逆转录反应,每管反应体系如下:总RNA l.0μg,AP 4 pmol ,
1.4.2 荧光标记差异显示PCR 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP],随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'),以逆转录产物为模板,进行PCR反应。反应体系包括:20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4) ,50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl2,逆转录产物3.0 μl,50 μ mol/L dNTP mi x(1∶1∶1),0.35 μmol/L 5'-随机引物,0.35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 U nits,总反应体系10 μl。
1.4.3 分离差异显示片段 配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶,胶厚0.2
1.4.4 回收差异条带 用AcquireSC软件将差异条带定位,用一次性手 术刀片切割下所需条带,置于30 μl去离子水中,
1.4.5 差异条带的再扩增 以经上述处理的回收条带为模板,T7启动子 22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3')、反M13(-48)24-mer(
2 结果
2.1 总RNA的质量
总RNA经Dnase I处理,用1.0%甲醛变性凝胶电泳,可见清楚的28 S、18 S、5 S条带 ,且28 S/18 S约为2∶1(图1),表明RNA完整性好,无降解现象。N、T1、T2的OD260/OD28 0比值分别为1.92、1.83、1.98,表明样品纯度高。
Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel
2.2 荧光标记mRNA差异显示
结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物,各组间比较见较多呈有无或强弱变 化的差异条带,图2中箭头所示。
Fig.2 Analysis of gene expression of c ells treated
with IFN and LPS by differential display technique
2.3 差异条带再扩增
取T2中约1.25Kb的条带再扩增,结果见图3。
Fig.3 Reamplification result of differ entially expressed
band DNA marker is 200 bp ladder (200 bp~2 kb),1.0kb is arro wed
3 讨论
基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异,是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示 技术[1],为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的 强弱等优点,一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而,该技术也存在着一些缺陷,主要表现为:cDNA产物的质量较低,在序列胶中往往呈不清晰状态[2];所 得的cDNA片段通常小于500 nt,往往是3'-端的非翻译(编码)序列;所得差异片段的假阳性 高,可高达85%[3]等。
荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进,极大减少了上述不足。
差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型,本实验通过使用双碱基锚定引物,将总mRNA群体分为12个亚群,这极大减小了每一锚定引物 产生的*条cDNA链的数量,不仅可降低随机引物的用量,更可降低DD产物的复杂性,使差示条带在序列胶上易于分辨,从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD的随机引 物的特点为A+T与G+C含量近乎相等,且
文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致[4]。通常,再扩 增的引物与DD引物相同,本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer),此为 在锚定引物的
用常规的序列分析胶进行分辨时,较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本操作改用5.6%的PAGE胶(聚丙烯酰胺),减少胶的厚度(仅250 μm),通过提高电泳的电压( 3000 V)及温度(
同位素标记存在曝光时间长、带型不佳,基本与相邻的带混合、污染等缺点,将荧光物 质标记于锚定引物的5'端,可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果,操作周期仅两天。
目前,DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理[5] 、病理过程相关的未知表达基因的研究,相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。
*“九五”医药卫生科研基金资助课题(
作者简介:王刚石(1968-),男,安徽歙县人,主治医师,博士 ,主要从事消化系统疾病的临床与基础研究。
4 参考文献
[1] Liang P, Pardee A B. Differntial display of eukaryotic messenger RNA by means of the Polymerase Chain Reaction [J]. Science,1992,257:967 -971.
[2] Shoham N G. Arad T, Rosin-Abersfeld R, et al. Differential display as say and analysis [J]. Biotechniques,1996,20(2):182-184.
[3] Zegzouti H. Improved screening of cDNAs generated by mRNA differential di splay enables the selection of true positives and the isolation of weakly expres sed messages[J]. Plant molecular Biology Reporter, 1997,15:236-245.
[4] Miele G. MacRae L, McBride D, et al. Elimination of false positives ge nerated through PCR reamplification of differential display cDNA[J].Biotec hniques,1998,25(1):138-144.
[5] Cirelli C, Tononi G. Differences in brain gene expresion between sleep and waking as revealed by mRNA differential display and cDNA microarray technolog y[J]. J Sleep Res,1999,8(Suppl)1:44-52.