猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒技术参数
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51次猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒
【产品名称】
商品名称:猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒
Name :Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit
【包装规格】50 次/盒
【产品及特点】
猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)会引起猪细小病毒病。这是一种猪繁殖
障碍病,该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡,特别是初产母猪发生死胎、畸
形胎和木乃伊胎,但母猪本身无明显的症状。猪群暴发此病时常与窝仔数减少、母
猪难产和重复配种等临床表现有关。在怀孕早期 30-50 天感染,胚胎死亡或被吸
收,使母猪不孕和不规则地反复发情,该病毒会给养猪业带来巨大的经济损失,因
此猪细小病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本公司开发猪细
小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2.引物和探针经过优化,灵敏性高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据猪细小病毒 DNA 高度保守区设计,不会跟其他微生物 DNA
发生交叉反应。
5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数
量级
6.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
7.本产品只能用于科研。
【规格及成分】
成分 包装
2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL(红盖)
荧光 PCR 专用模板稀释液 1 mL(绿盖)
超纯水 1ml(白盖)
猪细小病毒探针法 qPCR 引物-探针
混合液
150 μL(棕色盖)
猪细小病毒探针法 qPCR 阳性对照
(1×10E7 拷贝/μL)
50 μL(黄盖)
使用手册 1 份
【运输及保存】
低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
【自备试剂】
样品 DNA。
【使用方法】
一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)
由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污
染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 本产品不
提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。
2.用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头下同)。
3.在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分
钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充
分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充
分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7.如果有 N 个样品待提取,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备
阳性对照),和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10
μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为 PC。另
外用水作为 NC。
8.用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个
用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用
于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其
中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模
板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面
只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完
毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
成分/每管
样品管
N+2 个
PCR 阴
性对照管
标准曲线样品
管(1-6 管)
2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL
猪细小病毒探针法 qPCR 引物-探针
混合液
3 μL 3 μL 3 μL
N+2 个待测 DNA 模板 7 μL - - 超纯水 - 7 μL - 第 6 步所得标准曲线样品稀释液
(1-6 号) - - 7 μL(1 号样到
1 号管,2 号样到
2 管…)
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
过程 温度 时间
预变性 95℃ 10 min PCR 反应
(45 个循环)
95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec(采集 FAM 通道的荧光信号)
四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值
为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品核酸浓度
的 log 值,再推算出其浓度。
13.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于
或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等
于 35。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则
为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复实验的 Ct 值如果大于或等于
40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。