磷酸钙法转染HEK293T细胞
- 技术文章2012/7/27 15:41:31
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磷酸钙法转染HEK293T细胞
一.试剂配制
无菌水ddw： 高温灭菌； 分装；
2XHBS： 280mM NaCl
10mM KCl
1.5 mM Na2HPO4
12 mM glucose
50 mM HEPES
Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌，分装；
2M CaCl2： 过滤灭菌，分装。
二. 实验过程：
1. 铺细胞： 选择状态良好的293T细胞传代， 2-3x105个细胞/35mm dish。
2. 20-24h后，待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候，进行转染。下面就35mm dish为例，采用以下转染体系：
ddw： 105ul
plasmid： 2 ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）
2M CaCl2： 16.5ul
2XHBS： 125ul
按上述顺序，往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。
先将前三者混匀， zui后加2XHBS。
一种方法是，加2XHBS时要逐滴加入， 吹打至微现乳白色， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。
另一种方法是， 加入2XHBS后立即吹打约40下（不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定， 建议做一个梯度实验，吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打）， 之后步骤同上， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。