MTT检测试剂盒细胞凋亡与增殖
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详细信息
商品属性：
| 货号 | 规格 | 货期 | 英文名称 |
| CS-C6002 | 500次 | 1～3天 | MTT Assay Kit |
商品介绍：
MTT广泛用于检测细胞生长，其原理是MTT可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原生成深紫色的formazan结晶，而死细胞则无此活性。深紫色的formazan结晶被溶解后可以通过测定490nm波长的光吸收而测定出其浓度，并由此推测出细胞的活力，细胞增殖越旺盛，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。
产品特点：
1．采用的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，减少误差。
2．背景低，灵敏度高，线性范围宽，重复性好。
3．本产品为足够500次(5个96孔细胞培养板)微孔板检测。
4．可用于生物活性因子活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定等。
储存条件：低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存)，有效期一年。
使用方法：
下面操作是检测细胞毒性的试验，其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验)，操作步骤可以以此为基础稍作修改即可，故不再赘述。
㈠、接种细胞
1．按常规化法消化汇合的单层细胞，收集到含血清的培养基中。
2．200g离心5分钟收集细胞沉淀。
3．用培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬浮液并计数。
4．将细胞稀释到2.5×103个/mL～5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定)，如果不知道生长数度，一般可以稀释到1×10个/mL。
5．将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。
6．用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞，则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。注意：一定要把细胞加在孔的正中，否则细胞会聚集在孔的角落处，影响试验。
7．用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零)，第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11 列反应的影响。
8．按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天，使细胞进入指数生长期。
㈡、药物处理
9．用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度，则需要预试验确定)，一般一种药物需要做3块平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培养基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基，这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物，每列加入一个浓度的药物。
13．按常规方法把96孔板继续放在在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间，此段时间即为药物处理细胞的时间，由用户自己决定。
14．处理结束后去除第2 到第11列(共10列，均含细胞)所有孔中的培养基，并再加入100μL新鲜培养基。
15．每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。
㈢、存活细胞计数
16．在生长末期，去除第1到第11列各孔中的培养基后，再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分)，用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。注意：溶液A在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解，摇匀后使用。MTT有致癌性，一定要带手套操作。
17．小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收，尽可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置摇床上低速振荡10分钟，使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。
19．由于产物不稳定，故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。
注意：用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。
20．计数同样处理的各次重复的平均值。
21．以药物浓度为横轴，以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度对值差别很大，一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为)，这样便于计算出IC50，用于各种药物处理效果的比较。注意：如果测生长曲线，则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型，具有促进作用的则斜率加大。在细胞
步骤和注意事项：
准备实验环境：确保实验区域清洁，使用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干。
细胞培养：
准备试管或培养皿、细胞培养基和待培养的细胞。
取出保存于低温下的细胞苗，并加入培养基中，摇晃混合均匀。
用移液管将细胞培养基和细胞种植在试管或培养皿中。
将试管或培养皿放置于恒温培养箱中，定期更换培养液。
细胞冻存与复苏：
细胞系的冻存是将生长较好的传代细胞悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。
复苏则是将冻存的细胞系恢复到常温的过程，原则是“慢冻快融”，以较大限度地保存细胞活力。
细胞计数：
制备细胞悬液，使用消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。
在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
荧光显微镜使用：
使用荧光染料对细胞进行染色，并观察细胞所发出的荧光信号，以研究细胞结构和功能。
聚合酶链反应（PCR）：
准备PCR反应所需的DNA模板、引物、聚合酶和核苷酸。
按照PCR反应液配制表制备反应液。
在反应器中加入反应液，开始PCR反应。
PCR反应的成功与否，可以通过电泳、测序等方法进一步确认。
转染：
准备转染所需的载体DNA和细胞。
制备转染试剂，将DNA载体溶解于转染试剂中，与细胞混合均匀。
处理转染细胞，并进行下一步实验。
在操作过程中，应注意实验室安全规范，避免随意丢弃垃圾，及时登记购买耗材或试剂，保持实验环境的清洁和安全
下列是公司正在出售的产品：
| 细胞周期与凋亡检测试剂盒 | 自养无枝酸菌PCR检测试剂盒 |
| Alexa Fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒 | 中央无浆体PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式检测试剂盒 | 边缘无浆体PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 | 嗜吞噬细胞无浆体PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 | 无浆体通用PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒 | 十二指肠钩口线虫PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-APC细胞凋亡检测试剂盒 | 异尖线虫属PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒 | 变形丝囊霉菌PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-APC/PI双染双染细胞凋亡检测试剂盒 | 侵入性丝囊霉菌PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-kFluor488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 | 丙酸蛛网菌PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-kFluor555/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒 | 马隐秘杆菌PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-kFluor594细胞凋亡检测试剂盒(荧光显微镜专用) | 溶血隐秘杆菌PCR检测试剂盒 |
| Annexin V-kFluor647/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒 | 弓形杆菌属通用PCR检测试剂盒 |
| MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | 节菱孢霉属通用PCR检测试剂盒 |
| Caspase 3分光光度法检测试剂盒 | 马节杆菌PCR检测试剂盒 |
| Caspase 3荧光法检测试剂盒(AFC) | 节杆菌通用PCR检测试剂盒 |
| Caspase 2分光光度法检测试剂盒 | 蜜蜂球囊菌PCR检测试剂盒 |
| Caspase 2荧光法检测试剂盒(AFC) | 黄曲霉PCR检测试剂盒 |
| Caspase 8分光光度法检测试剂盒 | 烟曲霉PCR检测试剂盒 |
| Caspase 8荧光法检测试剂盒(AFC) | 构巢曲霉PCR检测试剂盒 |
| Caspase 6分光光度法检测试剂盒 | MTT检测试剂盒细胞凋亡与增殖赭曲霉PCR检测试剂盒 |
| Caspase 6荧光法检测试剂盒(AFC) | 寄生曲霉PCR检测试剂盒 |
