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ZC1042D ClearColi K12电转感受态细胞
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- ZC1042D
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详细信息
ClearColi K12 电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。ClearColi K12菌株来源于K12endA-recA-菌株。在K12 endA-recA-菌株中引入突变，导致ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖(LPS)被修饰:LPS的低聚糖链被删除，同时LPS的两个酰基链也被删除，进而破坏了ClearColi K12大肠杆菌的内毒素信号通路，使得从该细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低，提取的无内毒素质粒广泛应用于后续的哺乳动物细胞转化。ClearColiK12同时缺失核酸内切酶(endA)和重组酶(recA)，提高了质粒DNA的产量和质量。ClearColiK12电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达1X10cfu/μg DNA。基因型为: FλΔendAΔ recAfrr181 msbA52Δ gutQΔ kdsDΔ lpxL Δ lpxMΔpagPlpxP A eptA
操作方法:1.0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5min,待其沥干水分,正置5min,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5min充分降温。2.取 -70℃保存的电击感受态细胞插入冰中5min,待其融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手boda离心管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。A.测定转化效率使用1μl 0.1ng/μl 的对照质粒pUC19;B.对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5;1mM
EDTA)重悬,DNA浓度不超过100ng/μl,体积不超过5μl/50μl感受态。3.用 200μl 枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。4.启动电转仪,设置参数:C=25μF, PC=200Ω,V=1.8kV(BioRad电转仪推荐参数);或C=25μF,PC=200Ω.V=2.4kV(BTX ECM 630或Bio-Rad GenePulser电转仪推荐参数);也可按所用电转仪推
荐的参数操作。将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。5.2min后从冰中取出电击杯,放室温,加入700μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基(室温),用1ml
枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50ml离心管(BD Falcon50ml 锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C.培养基至5ml。37C,225rpm复苏60min。
