谷胱系列γ-谷氨酰连接酶(GCL)测试盒_微量法

测定方法：微量法

产品规格：100管/96样

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。

测定原理：

在ATP和Mg2+存在下，GCL催化Glu和Cys合成γ-谷氨酰Cys；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。

自备仪器和用品：

冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、浓硫酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体105mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加6 mL蒸馏水充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×1管，4℃保存。临用前加入蒸馏水1.5 mL充分震荡溶解。

试剂四：液体7mL×1瓶，室温保存。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入12 mL蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入400µL浓硫酸（自备），边加边搅拌。

谷胱系列γ-谷氨酰连接酶(GCL)测试盒_微量法

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.血清等液体：直接测定。

GCL测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2.空白管：取1.5mLEp管，依次加入试剂一48µL、试剂二52µL、试剂三12µL和蒸馏水24µL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15 min；再加入试剂四60µL，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心10 min，取上清100µL，加入试剂五100µL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm处光吸收，记为A空白管。

3.测定管：取1.5mLEp管，依次加入试剂一48µL、试剂二52µL、试剂三12µL和上清液24µL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15 min；再加入试剂四60µL，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心10 min，

4.取上清100µL，加入试剂五100µL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm处光吸收，记为A测定管。

注意：空白管只需要测定一次。