脂蛋白脂酶(LPL)﹠肝脂酶(HL)活性测定试剂盒
时间:2019-11-19 阅读:1882
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1882次测定意义:
LPL(lipoprotein lipase)存在于肝外组织毛细血管内皮细胞表面,催化血浆中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解,在CM及VLDL的降解中发挥重要作用。HL(hepatic lipase)仅存在于肝内皮细胞表面,在中密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)代谢中起重要作用。LPL 和HL活性降低,可引起高甘油三酯血症。在高脂血症、动脉粥样硬化的发病机理及脂蛋白代谢研究中,常常需要测定LPL及HL活性。
测定原理:
LPL和HL均能水解乳剂中TG,生成游离脂肪酸;进一步通过铜试剂法测定体系中游离脂肪酸的生成。
自备仪器和用品:
研钵、冰、台式离心机、微量注射器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、肝素钠、氯坊(三氯钾烷)、无水乙醇和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,室温保存。
试剂三:自备。实验前1 d,在10 mL试剂瓶中加入4.8 mL正庚烷,0.2 mL无水钾醇,5 mL氯坊(自备),盖紧后混匀,室温保存。
试剂四:液体×1瓶,室温保存。
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前向试剂瓶中加入5 mL无水乙醇,充分溶解。
标准品:粉剂×1瓶,室温保存。临用前向试剂瓶中加入7.8 mL氯坊充分溶解,即为500μmol/L的棕榈酸标准溶液。
粗酶液提取:
1、血液中LPL与HL活性测定:按动物体重,150U/kg肝素钠溶液静脉注射,20min后取血液,即下表中粗酶液,待测。
2、组织中LPL与HL活性测定:组织用生理盐水冲洗干净后,用吸水纸吸取表面水分,称取约0.1 g样品,加入1 mL生理盐水,冰浴匀浆,8000rpm,4℃离心10min,取上清液,即粗酶液,待测。
LPL和HL测定操作:
1. 分光光度计预热30 min以上,调节波长到550 nm,蒸馏水调零。
2. 空白管:取带盖 玻璃试管,加入2 μL蒸馏水,100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A空白管。
3. 标准管:取带盖 玻璃试管,加入2 μL标准液,100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A标准管。
4. 总脂酶测定管:取带盖玻璃试管,加入10 μL粗酶液,100μL蒸馏水,100μL试剂二,盖紧后混匀;37℃水浴准确保温60min;吸取2μL上述溶液,加入另一个0.5mL EP管,加入100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A总脂酶管。
5. 肝脂酶测定管:取带盖玻璃试管,加入10 μL粗酶液,100μL试剂一,100μL试剂二,盖紧后混匀;37℃水浴准确保温60min;吸取2μL上述溶液,加入另一个0.5mL EP管,加入100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A肝脂酶管。
LPL和HL活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.血液中LPL与HL活性计算
活性单位定义:37℃中每毫升血清(浆)每分钟在反应系统中所产生的 1 μ mol FFA。
总脂酶活性(U/mL)=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总)÷T
=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
肝脂酶(HL)活性(U/mL)=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL)=总脂酶活性-HL
C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mL;V反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mL;V样:加入催化反应体系中粗酶液体积,10μL;V样总:粗酶液总体积,1mL=1000μL;T:催化反应时间,15 min。
2. 组织中LPL与HL活性计算
(1)按蛋白浓度计算
37℃中每毫克蛋白每分钟内催化产生1μmol FFA。
总脂酶活性(U/mg pr)
=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr
肝脂酶(HL)活性(U/mL)
=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr
脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL)=总脂酶活性-HL
(2)按样本鲜重计算
37℃中每克样品每分钟内催化产生1μmol FFA。
总脂酶活性(U/g 鲜重)
=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
肝脂酶(HL)活性(U/mL)=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL)=总脂酶活性-HL
C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mL;V反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mL;V样:加入催化反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL;T:催化反应时间,15 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
1.血液中LPL与HL活性计算
活性单位定义:37℃中每毫升血清(浆)每分钟在反应系统中所产生的 1 μmol FFA。
总脂酶活性(U/mL)=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总)÷T
=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
肝脂酶(HL)活性(U/mL)=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL)=总脂酶活性-HL
C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mL;V反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mL;V样:加入催化反应体系中粗酶液体积,10μL;V样总:粗酶液总体积,1mL=1000μL;T:催化反应时间,15 min。
2. 组织中LPL与HL活性计算
(1)按蛋白浓度计算
37℃中每毫克蛋白每分钟内催化产生1μmol FFA。
总脂酶活性(U/mg pr)
=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr
肝脂酶(HL)活性(U/mL)
=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr
脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL)=总脂酶活性-HL
(2)按样本鲜重计算
37℃中每克样品每分钟内催化产生1μmol FFA。
总脂酶活性(U/g 鲜重)
=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
肝脂酶(HL)活性(U/mL)=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL)=总脂酶活性-HL
C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mL;V反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mL;V样:加入催化反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL;T:催化反应时间,15 min。