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脂蛋白脂酶(LPL)﹠肝脂酶(HL)活性测定试剂盒

时间:2019-11-19      阅读:1882

测定意义:

LPLlipoprotein lipase)存在于肝外组织毛细血管内皮细胞表面,催化血浆中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解,在CMVLDL的降解中发挥重要作用。HLhepatic lipase)仅存在于肝内皮细胞表面,在中密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)代谢中起重要作用。LPL HL活性降低,可引起高甘油三酯血症。在高脂血症、动脉粥样硬化的发病机理及脂蛋白代谢研究中,常常需要测定LPLHL活性。

测定原理:

LPLHL均能水解乳剂中TG,生成游离脂肪酸;进一步通过铜试剂法测定体系中游离脂肪酸的生成。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、微量注射器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、肝素钠、氯坊(三氯钾烷)、无水乙醇和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体×1瓶,4保存。

试剂二:液体×1瓶,室温保存。

试剂三:自备。实验前1 d,在10 mL试剂瓶中加入4.8 mL正庚烷,0.2 mL无水钾醇,5 mL氯坊(自备),盖紧后混匀,室温保存。

试剂四:液体×1瓶,室温保存。

试剂五:粉剂×1瓶,4保存。临用前向试剂瓶中加入5 mL无水乙醇,充分溶解。

标准品:粉剂×1瓶,室温保存。临用前向试剂瓶中加入7.8 mL氯坊充分溶解,即为500μmol/L的棕榈酸标准溶液。

粗酶液提取:

1血液中LPLHL活性测定:按动物体重,150U/kg肝素钠溶液静脉注射,20min后取血液,即下表中粗酶液,待测。

2组织中LPLHL活性测定:组织用生理盐水冲洗干净后,用吸水纸吸取表面水分,称取约0.1 g样品,加入1 mL生理盐水,冰浴匀浆,8000rpm4离心10min,取上清液,即粗酶液,待测。

LPLHL测定操作:

1. 分光光度计预热30 min以上,调节波长到550 nm,蒸馏水调零。

2. 空白管:取带盖 玻璃试管,加入2 μL蒸馏水,100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A空白管。

3. 标准管:取带盖 玻璃试管,加入2 μL标准液,100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A标准管。

4. 总脂酶测定管:取带盖玻璃试管,加入10 μL粗酶液,100μL蒸馏水,100μL试剂二,盖紧后混匀;37水浴准确保温60min;吸取2μL上述溶液,加入另一个0.5mL EP管,加入100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A总脂酶管。

5. 肝脂酶测定管:取带盖玻璃试管,加入10 μL粗酶液,100μL试剂一,100μL试剂二,盖紧后混匀;37水浴准确保温60min;吸取2μL上述溶液,加入另一个0.5mL EP管,加入100μL试剂三,40 μL试剂四,40μL试剂五,盖紧后充分震荡混匀(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,静置15min,于550nm光吸收,记为A肝脂酶管。

LPLHL活性计算:

 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.血液中LPLHL活性计算

活性单位定义:37中每毫升血清(浆)每分钟在反应系统中所产生的 1 μ mol FFA

总脂酶活性(U/mL=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V÷V样总)÷T

=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=总脂酶活性-HL

C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mLV反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mLV样:加入催化反应体系中粗酶液体积,10μLV样总:粗酶液总体积,1mL=1000μLT:催化反应时间,15 min

2. 组织中LPLHL活性计算

1)按蛋白浓度计算

37中每毫克蛋白每分钟内催化产生1μmol FFA

总脂酶活性(U/mg pr

=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(Cpr×V)÷T

=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

肝脂酶(HL)活性(U/mL

=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=总脂酶活性-HL

2按样本鲜重计算

37中每克样品每分钟内催化产生1μmol FFA

总脂酶活性(U/g 鲜重)

=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V÷V样总×W)÷T

=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=总脂酶活性-HL

C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mLV反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mLV样:加入催化反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mLV样总:提取液体积,1 mLCpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mLT:催化反应时间,15 min

b.使用96孔板测定的计算公式如下

1.血液中LPLHL活性计算

活性单位定义:37中每毫升血清(浆)每分钟在反应系统中所产生的 1 μmol FFA

总脂酶活性(U/mL=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V÷V样总)÷T

=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=总脂酶活性-HL

C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mLV反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mLV样:加入催化反应体系中粗酶液体积,10μLV样总:粗酶液总体积,1mL=1000μLT:催化反应时间,15 min

2. 组织中LPLHL活性计算

1)按蛋白浓度计算

37中每毫克蛋白每分钟内催化产生1μmol FFA

总脂酶活性(U/mg pr

=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(Cpr×V)÷T

=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

肝脂酶(HL)活性(U/mL

=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=总脂酶活性-HL

2按样本鲜重计算

37中每克样品每分钟内催化产生1μmol FFA

总脂酶活性(U/g 鲜重)

=[ C标准液÷(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V反总÷(V÷V样总×W)÷T

=0.7×(A总脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=总脂酶活性-HL

C标准液:标准品浓度,500 μmol/L=0.5 μmol/mLV反总:催化反应体系总体积,10+100+100=210μL=0.21 mLV样:加入催化反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mLV样总:提取液体积,1 mLCpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mLT:催化反应时间,15 min

 

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