非甲基化寡核苷酸ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法：

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

4. 酶标仪（450nm）

5. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

6. 37℃恒温箱

非甲基化寡核苷酸ELISA试剂盒操作注意事项：

11.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解后再使用。

12.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

13.预处理后的样本无需稀释，直接取50μL加样即可。

14.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

15.所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

5.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

6.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤：

15.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

16.设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

17.待测样本孔各加待测样本50μL；

18.随后标准品孔和样本孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

19.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

20.所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

21.所有孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。