裂谷热诊断技术--ELISA方法
时间:2011-06-15 阅读:519
直到2000年,裂谷热只限定在非洲流行,但是zui近在阿拉伯半岛致死性的暴发,表明需要快速诊断、有效地处理和预防这一疾病。
该病由于没有特征性的临床症状,因此个别病例的诊断较为困难,但是该病具有以下流行特征:众多动物流产,新生畜大批死亡,乃至人群发病。RVFV通常流行于非洲国家,流行常伴随着特大降雨的周期循环,较少发生在半干旱地区(30—35年的周期),或者较频繁(3~10年的周期)发生在较大雨量的草原地区。
经典的检测裂谷热病毒抗体的参考方法是建立在多种形式的病毒中和试验(VN)和血凝抑制试验基础上的,包括微量中和试验,蚀斑减少中和试验(PRN),小白鼠中和试验等,主要用来检测不同动物血清中的病毒特异性抗体,因只能用活病毒进行试验,不适合疫区外使用。尽管它们具有较高的灵敏度和特异性,但是价格昂贵且耗时,那些方法的一个很大的不利之处是对试验人员具有健康风险,并且限制了它们在非疫区国家的使用。酶联免疫吸附试验(ELISA)、血凝抑制(H1)、琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)、免疫荧光试验和补体结合试验等,均可用于检测病毒,但这些试验的结果与白蛉热病毒属的其他血清型有交叉性,这些试验可用灭活抗原进行,可用于无裂谷热的国家。
ELISA具有较高的可靠性和灵敏度,可利用几种抗原检测RVFV特异性抗体,OIE参考实验室建立了间接ELISA,以灭活的细胞培养物作为抗原,使用G蛋白—辣根过氧化物酶结合物,该试验较为灵敏,可于数小时检测出RVFV抗体;用于ELISA检测的抗原、标准血清和操作程序均可以从参考实验室获得。
OIE诊断手册上的试验程序如下(除非其他说明,使用的体积均为50ul/孔,所有的稀释液用3g/100ml脱脂奶缓冲液,并且所有的洗涤进行3次)。
①以预先确定的浓度分别用阳性抗原和阴性抗原包被半块板,每孔 50ul。4℃孵育过夜。洗板。
②每孔加入100~L封闭液,37℃孵育1h。洗板。
③将待检血清和对照血清以预先确定的浓度分别加入到阳性和阴性抗原孔中,每份两个重复。37℃孵育1h。洗板。
④加人工作浓度的G蛋白—辣根过氧化物酶结合物。37℃孵育1h。洗板。
⑤加入提供的四甲联苯胺底物,然后将板室温(22℃)避光保存20min(显色时间)。
⑥加入终止液(2mol/L硫酸),然后在450nm/650nm的光密度下读板。
Paweska等建立了间接ELISA、IgG夹心ELISA和IgM捕获ELISA检测裂谷热抗体,以适应当前日益增长的与临床诊断、风险评估和风险因子研究相关的诊断灵敏性和特异性的可靠评估。与病毒中和试验和血凝抑制试验相比,IgG夹心ELISA在检测裂谷热病毒早期感染或免疫zui早的免疫球蛋白反应时更加灵敏。从田间取得的数据表明,它的灵敏性和特异性在不同反刍动物中分别固定在99.5%~100%和99.1%~99.9%之间。IgG捕获ELISA的特异度在不同动物种类中从97.4%一99.4%之间变化;它的灵敏度在绵羊感染后的5—42天是100%。
当然,这一疾病的诊断应当包括多种程序,如病毒在细胞培养中的分离,抗原的ELISA试验,确实的PCR方法,或者通过免疫吸附试验或者免疫荧光试验来检测病毒特异性IgG和IgM,同时这些诊断技术还应当与临床症状、病理变化、流行病学调查等相结合。