[器材和试剂]

●  LB+Amp

●  LB+Amp/Glu[LB ，50ug/ml Amp，l％葡萄糖]

●  IPTG

●  M13K07辅助噬菌体（Stratagene）

●  PEG 8000（Sigma）

●  NaCl

●  TBS

●  SW40异质同晶聚合物管（Beckman）

 

[方法]

1．将含有单克隆噬菌粒的菌落接种到10ul LB+Amp/Glu中，37℃过夜培养（在lac启动  子的控制下，葡萄糖能抑制pⅧ基因的表达）。

2．用500ml LB+Amp稀释过夜培养液，使之OD₆₀₀＝0．05；并在37℃下用2L烧瓶剧烈  振荡培养（至少300r/min），直到OD₆₀₀＝0．25。

3．37℃极温和搅动孵育15分钟。加入IPTG（终浓度为0．1mmol/L）诱导源自lac启动  ·子的pⅧ表达，并用辅助噬菌体M13K07（mol＝30）进行超感染。混合并在37℃下静置15分钟感染。37℃剧烈振荡孵育培养物5小时。

4．将细菌/噬菌体上清在4℃5000r/min离心30分钟，回收上清液。

5．加PEG 8000和NaCl溶液（其终浓度分别为4％和0．5mol/L）沉淀噬菌体颗粒，4℃冰上4小时。

6．4℃5000r/min离心40分钟回收噬菌体沉淀，并用1/10原体积的TBS重悬。

7．70℃水浴孵育噬菌体上清30分钟，使污染的细菌蛋白变性；再4℃10000r/min离心30分钟除之。

8．将PEG 8000/NaCl加入所得到的上清，再次沉淀噬茵体，4℃冰上孵育2小时。

9．4℃10000r/min离心30分钟，  用10ml PBS重悬噬菌体沉淀。  以8000r/min再次离心15分钟，以去除不溶物质。   

10．在LB+Amp平板上滴定噬菌体TU值。