1、混合酸酐方法；

    2、CDI方法；

    3、NHS酯方法。

 

    混合酸酐方法通常既简单而又直接，小分子的羧基转变成可与蛋白氨基反应的酸酐。反应时，一般每摩尔蛋白中加入10～20mol小分子。这种方法已被用于雌二醇—HRP，可的松—b—半乳糖苷酶等酶结合物的制备，产率约为25％。下面举一例子说明混合酸酐方法是如何进行的。

 

    1．混合酸酐方法

 

    目的：用于methotrexate（MTX）与p—半乳糖苷酶结合物的制备

 

    操作步骤：

    （1）溶解5．8mgMTX于0．1ml DMF中，冷却至10~C，加入2／ll isobutyl choroformate，10~C搅拌30min；

    （2）溶解1．5mgp—半乳糖苷酶于2ml 50mmol／LNazC03溶液中；

    （3）10~C反应4h，按要求加NaOH使溶液pH保持在9．0，然后4℃过夜；

    （4）用含100retool／L NaCl，10retool／L MgClz和10mmol／L 2—巯基乙醇的50 mmol／L Tris—醋酸缓冲液（pH7．5）平衡的SephadexG-25过滤分离结合物和未结合的化合物，收集含酶的部分，进一步纯化后，加0．1％（W／V）BSA和0．02％（W／y）NaN₃

    CDI方法较为常用，结合物得率约为20％，已被用于小分子与p—半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等的连接。CDI方法结合反应条件简单，载体蛋白、过量的小分子和交联试剂在pH 6．0的缓冲液中至少搅拌30rain。

    NHS酯方法其实是CDI方法的一个变异方法，即其先使DCC或另一种CDINHS酯化。这种方法可用于水溶性CDI不能使用的结合反应。下面举例说明。

 

    2．N—羟琥珀酰亚胺酯方法

 

    目的：用于*与p—半乳糖苷酶结合物的制备。

 

    操作步骤：

    （1）溶解*—11—半琥珀酸盐于dioxane中至100 mmol／L浓度；

    （2）在200 mmol／LDCC存在下，与100 mmol／LN—羟琥珀酰亚胺14~C反应16h；

    （3）薄层层析纯化所形成的酯，展开剂为氯仿：乙醇（9：1）；

    （4）按*／酶为10／1的摩尔比将上述酯加入到b—半乳糖苷酶溶液（于50 mmol／L，pH 7．4）中。