对于激素和肿瘤标志物来说，一级和二级标准品通常稀释于人工含蛋白的缓冲液中，对所有复溶和稀释都应进行称重校正，并根据不同稀释度的回归线的斜率定值。复溶后，一级和校准的二级标准品应分装成小包装，密封于玻璃安瓿中一70℃下保存。二级标准品通常用低蛋白含量（例如0．5％～1．0％的清蛋白）的缓冲液制备，但校准品应以血清为基质或用蛋白含量类似于血清的缓冲液制备。这一点对用来传递值的测定方法有较严格的要求，即其基本不受基质不同的影响。可通过测定稀释于零校准晶中的样本来确证没有基质效应。理想情况下，应使用参考方法来进行值的传递，但对于多肽激素和肿瘤标志物来说尚无此类方法。用于校准品制备的无内源性激素的基质，可使用已去掉激素的病人血清。可通过使用特异抗体的免疫吸附方法将多肽激素从血清中去除，但这种方法常会少量抗体在血清中，这种抗体对相应的免疫测定方法会有所干扰。有时也使用动物血清或人工蛋白缓冲液作为制备基质，这些基质各有其优缺点。人血清是zui自然的基质，但较难大量得到，使得每批标准品的量有限，需频繁更换，每批之间总会有微小差异。动物血清虽可大量得到，但其整体上的特性与人血清是不一样的，并且动物激素与人激素可能会有交叉反应。蛋白缓冲液则缺乏正常血清中所具有的大部分干扰物质，如果样本体积相对总的测定体积较小（10％～15％）的话，这些影响通常可以忽略不计。

    对于类固醇激素来说，由于结合蛋白的干扰，对结合蛋白的激素的直接测定的校准较为复杂。因为结合蛋白的亲和力与所使用的测定抗体相类似，所以在测定中必须使用分离物质以替代离开结合蛋白的激素，很难在不干扰抗体结合的情况下*排除结合蛋白的影响。因此，要有以血清为基础的校准品。无类固醇的血清可通过木炭吸附的方式制备，可将溶解在乙醇中的纯类固醇加入至去除内源性类固醇的血清中制备校准品，但仍发现有异常结合蛋白可引起较大的偏差，如具有高性激素结合球蛋白（SHBG）的样本用于睾酮直接测定时结果偏低，但SHBG稍有异常的样本，则测定结果偏高。除了结合蛋白，所有影响其他免疫测定的非特异因素也影响类固醇和甲状腺激素的测定。为改善方法的测定下限，样本在总的测定体积中的比例很高，因此，存在于样本中的非特异因素是测定误差的重要来源。对类固醇激素提取方法的校准非常简单，标准品可得到商品纯品，将其称量后溶于有机溶剂（通常为乙醇）可制备校准品贮备液，类固醇的含量可采用光电比色确认。稀释贮备液即可得到校准晶应用液。

标准品定值的测定方法可使用参考方法。定义方法（definitivemethod）是一个具有高精密度及没有系统偏差的参考方法。放射性核素稀释质量分光光度法（isotope dilution-mass spectrometry，ID-MS）可作为类固醇激素和其他一些小分子测定的定义方法，但这种方法极为昂贵因此难于大规模使用。用于蛋白测定的质量分光光度法虽在快速发展，但仍无合适的方法用于复杂生物学样本中低浓度多肽的定量测定。当没有定义方法可使用时，则可确定一个参考方法，例如有人提出了载脂蛋白B的参考方法。hCG测定标准化工作组推荐了可用于不同hCG变异体测定的参考方法。这种参考方法应有低测下限、不受非特异干扰及不与相关的化合物发生交叉反应，同时还应该容易得到。尽管所有关键试剂都相同，但在测定具体设计上的差异仍会引起偏倚，因此，有必要建立一个参考实验室的网络，以保持参考方法的有效性。