小鼠色素上皮衍生因子（PEDF）酶联免疫分析（ELISA）
                                          

      试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用              目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相
关液体样本中色素上皮衍生因子（PEDF）的含量。
实验原理：
   本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠色素上皮衍生因子（PEDF）水平。用纯化的
小鼠色素上皮衍生因子（PEDF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依
次加入色素上皮衍生因子（PEDF），再与 HRP 标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶
标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，
并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的色素上皮衍生因子（PEDF）呈
正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠色
素上皮衍生因子（PEDF）含量。

试剂盒组成：
试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存
说明书 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 个 1 个
酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
标准品：180μg/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶标试剂 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
样品稀释液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
显色剂A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
显色剂B液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
终止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
浓缩洗涤液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存

样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心
20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次
离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞
浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分
钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备
用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器
将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待
检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7.  不能检测含NaN3的样品，因 NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在*、第二孔中分别加标
准品 100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二
孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各
取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混
匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准
品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，
浓度分别为120μg/L，80μg/L ，40μg/L，20μg/L， 10μg/L）。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样
品zui终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混
匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液：将 30（48T的 20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的 20倍）倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此
重复 5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同 3。
8. 洗涤：操作同 5。9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止
液后 15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间
控制在5 分钟内，如标本数量多，*使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值
大于标准品孔*孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.  如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，    
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD     
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释     
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标     
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值     
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释     
倍数，即为样品的实际浓度。                  
  
                                                
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2.批内与批见应分别小于9%和 11%
检测范围：                                                 
5μg/L-150μg/L                                         
                             
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月