不同抗体，即使是同一公司的抗体，其佳的抗体稀释度也是不一样的，需要在实验中摸索。转膜过夜没有必要，转膜的目是将蛋白转到膜上，不必浪费时间。具体的转膜时间，要根据目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗可以过夜，如果想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，一般37度，两小时；也可以参照抗体说明书。一抗和二抗得稀释度，一抗1：1500；二抗1：20000。洗膜时，可以多洗几次，是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min。