一、服务介绍

   免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

   二、实验原理

   将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

   三、实验流程

   免疫荧光单标记方法

   免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。

   1、所需材料与试剂

   a、培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。

   b、一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

   c、4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。

   d、封闭液。

   e、 0.01mol／LPBS缓冲液。

   2、染色方法

   a、取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

   b、加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

   c、加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

   d、正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。

   e、去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。抗体以0.01 mo/LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。

   f、0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

   g、加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

   h、0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用滤纸吸干。

   i、90%甘油(PBS配制)封片。

   j、激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。

   免疫荧光双标记方法

   免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠，且尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下，染色时两种一抗可以同时孵育，然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。

   四、客户提供

   细胞株或细胞爬片。注：细胞爬片不宜太密；细胞必须固定。组织切片，一抗

   五、公司提供

   基本实验步骤、药品、样品处理、图片及图片分析，荧光显微镜或共聚焦显微镜拍摄

   实验周期：1-3周