植物清除活性氧

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H2O2 氧化 AsA，是植物 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到 AsA 的含量，APX 与 AsA 具有一定的负相关性。

测定原理：

APX  催化催化 H2O2 氧化 AsA，通过测定 AsA 氧化速率，来计算得 APX 活性。

自备仪器用品：

低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 90mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体 5mL×1 支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

测定：

1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃中预热 30min。

3. 依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、700μL 预热的试剂一、100μL 试剂二和

100μL 试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10 s 和 130 s 光吸收 A1 和 A2，△A=A1-A2。

APX 活性计算公式：

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(μmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁶÷(Cpr×V 样)÷T

=1.79×△A÷ Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：每 g 组织每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。 APX(μmol/min/g 鲜重 ) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁶÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=1.79×△A ÷W

ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000μL=1×10^-3 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样本质量，g；T：催化反应时间（min），2min。

注意事项：

配制好的试剂二 4℃保存，并且 3 天内使用完。

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