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描述：生产的组织细胞 miRNA 提取试剂盒是目前世界 上提取小 RNA（<200nt）操作步骤重复性好、 小 RNA 产率高的方法。使用该试剂盒提取的小 RNA （Small RNA）中，长度在 15～200nt 范围的 RNA 在 95% 以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。使用该试剂通过一步上 柱即可获得高纯度 miRNA，可在 45min 内完成小 RNA 的提 取。该试剂盒广泛适用于动物组织、细胞和多糖多酚含量不 高的植物组织样本。

储存：室温可保存 2 年。

使用防护建议：miRNA Reagent A 溶液中含有胍盐，其具有 强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等 防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就 医。

操作方法： 1. 组织样本提取 (1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。植物组 织则再加入 10μl β-巯基乙醇，混合均匀。 (2) 在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见 样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震荡至组织粉末溶解于裂 解液中。室温静置 5min 以充分裂解细胞。 注意：将组织加入到 miRNA Reagent A 后要迅速将组织震散，否 则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务移液器 将团状组织吹打松散。 (3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 350μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm 离心 5min，吸取 550μl 上清液，转移到新的 1.5ml EP 管中。 (4) 向上述溶液中加入 200μl 无水乙醇，手腕用力震荡数次， 室温放置 5min。 (5) 13,000rpm 离心 10min，转移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数 次。 (7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。 (11) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使 残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物 即为提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 该产物，即可使用 一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，

2. 细胞样本提取 (1) 贴壁细胞：消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重悬细胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 颠倒混 合均匀，室温放置 5min。 (2) 悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重悬细胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 颠倒混合均匀， 室温放置 5min。 (3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 250μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13,000rpm 离心 5min，吸取 550μl 上清液，转移到新的 1.5ml EP 管中。 注意：加入细胞体积数与 miRNA Reagent B 总体积数为 350μl。如加入 50μl细胞，则 miRNA Reagent B使用 300μl。 (4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 无水乙醇，手腕用 力震荡数次，室温放置 5min。 (5) 13,000rpm 离心 10min，转移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数 次。 (7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm 离心 1min，倒掉过滤液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。 (11) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使 残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物 即为提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 该产物，即可使用 一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，。

常见问题汇总： (1) 本方法提取的小 RNA，95％以上为小 RNA（200nt 的 RNA，通常残留的>200nt RNA 不影响后续试验操作。 (2) 本试剂盒提取的小 RNA 由于不含 mRNA 等大分子量的 RNA，因此更适合做后续反转录试验，从而进行定量试验。 (3) 使用本试剂盒提取的 miRNA 浓度通常在 50ng/μl 左右， 取 5～10μl 即可用于电泳检测。取 1~2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应

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