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描述：pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min 就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产 品适用于 Taq 酶扩增的含“A"尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉抗性筛选标记。 

注意：RTS DH5α 冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2 年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3 个月）。
主要特征
（1）快速连接，最快仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含
任何酶切位点，便于后续亚克隆（5）平末端和 A 尾产物通用。
注意：引物不能磷酸化。
测序引物
正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；

操作步骤
1. PCR 产物的纯化
1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂
盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。
1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。
2. PCR 用量和连接时间
PCR 产物大小 PCR 产物用量 载体用量 摩尔比 连接时间 阳性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 连接反应
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂
成 分 用 量
PCR 产物 0.5~4 μl （用量参考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加无菌水至总体积为 5 μl
轻轻吹打混合均匀后，室温（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。
关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物
的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连
接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效
率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。

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