测定意义：

AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体25 mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1管，-20℃保存。临用前加蒸馏水1mL充分溶解，4℃保存。

试剂四：液体2 mL×1管，4℃保存。

试剂五：粉剂×1管，4℃避光保存。临用前加入试剂二1mL充分溶解，4℃避光保存。

粗酶液提取：

称取约0.1g样品，加试剂一1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃离心20min，取上清液待测。

AAT测定操作：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到412 nm，蒸馏水调零；水浴锅35℃预热。

2. 对照管：依次在500μL EP管中依次加入140μL试剂二、10μL试剂三、20μL试剂四和10μL试剂五，20μL待测液，室温放置10min后于412nm测定吸光度，记为A1。

3. 测定管：依次在500μL EP管中依次加入140μL试剂二、10μL试剂三、20μL试剂四和20μL待测液，35℃水浴15min，加10μL试剂五，室温放置10min后于412nm测定吸光度，记为A2。△A测=A2-A1。

AAT活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

AAT活力单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。

AAT (U/mg prot) = 1000×△A测×V总÷(Cpr×V样) ÷T= 666.7×△A测÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

AAT活力单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。

AAT (U/g 鲜重) = 1000×△A测×V总÷(V样÷V样总×W) ÷T= 666.7×△A测÷W

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V总：反应总体积，0.2 mL；W ：样品质量；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，15min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

AAT活力单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.0005个单位为1U。

AAT (U/mg prot) = 2000×△A测×V总÷(Cpr×V样) ÷T=1333.4×△A测÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

AAT活力单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化0.0005个单位为1U。

AAT (U/g 鲜重) = 2000×△A测×V总÷(V样÷V样总×W) ÷T= 1333.4×△A测÷W

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V总：反应总体积，0.2 mL；W ：样品质量；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，15min。

注意事项：

上清液蛋白质含量需要另外测定。建议购买本公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒。