测定意义：

ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD⁺没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，室温保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。临用前把试剂三转移到试剂二中，4℃保存。                 

试剂三：粉剂×1瓶，－20℃保存。

试剂四：液体×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、称取约0.1g样品，加试剂一1ml，冰上充分研磨，16000g 4℃离心20min，取上清待测。2、血清可以直接用于测定。

ADH测定操作：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴中保温30 min以上。

3. 空白管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL蒸馏水、160μL试剂二和20μL试剂四，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。空白管只需做1~2个。

4. 测定管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL上清液、160μL试剂二和20μL试剂四，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A测定管=A3-A4。

ADH活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH 为1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T

=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH 为1U。

ADH (U/g 鲜重) =[(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(V样÷V样总×W)÷T

=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷W

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH 为1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T

=3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH 为1U。

ADH (U/g 鲜重) =[(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(V样÷V样总×W)÷T

=3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷W

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

注意事项：

上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。