测定意义：

FAS是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

测定原理：

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP⁺；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP⁺没有；通过测定340nm 光吸收下降速率，计算FAS活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解冻后混匀。

试剂二：粉剂×1瓶。临用前加入440μL试剂四，充分溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入440μL试剂四，充分溶解。

试剂四：液体×1瓶, 4℃保存。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入840μL试剂四，充分溶解。

粗酶液提取：

称取约0.1g样品，加试剂一1 mL充分研磨，16000rpm 4℃离心40min，取上清液，待测。

FAS测定操作：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min以上。

3. 空白管：在500μL EP管中依次加入20μL蒸馏水、4μL试剂二、4μL试剂三、164μL试剂四和8μL试剂五，迅速混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A空=A1-A2。

4. 测定管：在500μL EP管中依次加入20μL上清液、4μL试剂二、4μL试剂三、164μL试剂四和8μL试剂五，迅速混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A测=A3-A4。

FAS活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T

=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/g 鲜重)= [(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W) ÷T

               =1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷W          

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T

=3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/g 鲜重)= [(△A测定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W) ÷T

               =3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷W   

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

注意事项：

上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。