测定意义：

FFA既是脂肪水解的产物，又是脂肪合成的底物。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关。

测定原理：

FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐，并溶于氯坊；利用铜试剂法测定铜离子含量，即可推算出游离脂肪酸含量。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、一个25 mL玻璃瓶、两个10 mL玻璃瓶、正庚烷、无水甲醇、氯坊（三氯钾烷）、无水乙醇和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，室温保存。

试剂二：自备。实验前1 d，加入4.8 mL正庚烷，0.2 mL无水甲醇，5 mL氯坊（自备），盖紧后混匀，室温保存。

试剂三：液体×1瓶，室温保存。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前在试剂瓶中加入4 mL无水乙醇，充分溶解。

标准品：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加入7.8 mL氯坊充分溶解，即为500μmol/L的棕榈酸标准溶液。

样品中FFA提取：

1、血液中FFA测定：将所取血液，室温静置1 h 后，于4 ℃ 离心机3 500 rpm离心15min，取上层血清置于-20℃冰箱保存，待测

2、组织中FFA含量测定：组织用生理盐水冲洗干净后，用吸水纸吸取表面水分，称取约0.1g，加入1 mL试剂一，匀浆后，8000rpm，4℃离心10min，取上清液，稀释5倍，待测。

测定：

1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入10μL蒸馏水，100μL试剂二，40μL试剂三，40μL试剂四，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A空白管。

3. 标准管：取0.5mL EP管，加入10μL标准液，100μL试剂二，40μL试剂三，40μL试剂四，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A标准管。

4. 测定管：取0.5mL EP管，加入10μL上清液，100μL试剂二，40μL试剂三，40μL试剂四，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A测定管。

FFA含量计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血液FFA含量

FFA含量（μ mol/L）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] 1 L×5

=2500×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

2、组织FFA含量

（1）按样本蛋白浓度计算

FFA含量（μ mol/g 鲜重）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V样总÷Cpr ×5=2.5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

FFA含量（μ mol/g 鲜重）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V样总÷W×5=2.5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W

C标准液：500μmol/L；1 L：指每升样品；V样总：上清液总体积，1 mL=0.001L；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

1、血液FFA含量

FFA含量（μ mol/L）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×1 L×5=2500×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

2、组织FFA含量

（1）按样本蛋白浓度计算

FFA含量（μ mol/g 鲜重）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V样总÷Cpr×5 =2.5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

FFA含量（μ mol/g 鲜重）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V样总÷W×5=2.5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W

C标准液：500μmol/L；1 L：指每升样品；V样总：上清液总体积，1 mL=0.001L；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

注意事项：

1. 试剂四配制应尽量晚配，可在操作到加入试剂三时，再配制试剂四。

2. 该试剂盒不可用塑料比色皿和96孔板测定，需用玻璃比色皿。