测定意义：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体，是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶，产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外，β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，比传统的漂白法环保，具有广泛的应用价值。

测定原理：

β-木糖苷酶催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚，对硝基苯酚在405nm处有特征吸收峰，测定405nm光吸收增加速率，可计算β-木糖苷酶活性。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体1mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 植物样本：称取约0.1g样品，加1mL提取液充分冰浴匀浆，然后12000rpm，4℃，离心20min，弃沉淀 ，取20μL上清测定蛋白含量，剩余上清作为待测酶液。
2. 细菌、真菌样本：收集约500万个细胞，加入1mL提取液，超声波破碎（冰浴，功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，弃沉淀 ，取20μL上清测定蛋白含量，剩余上清置于冰上待测。

测定操作表：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，对照管调零。
2. 操作表

β-木糖苷酶活性计算公式：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=3.34x-0.001，R²=0.9991

（1）按蛋白含量计算

酶活定义：45℃，pH7.4时，每毫克蛋白质1min内催化产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=（A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀释倍数×1000 ÷Cpr

= 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时，每克样品1min内催化产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（U/g 鲜重）= （A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀释倍数×1000 ÷W

                           = 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时，每10⁴个细胞1min内催化产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（U/10⁴ cell）=（A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀释倍数×1000 ÷细胞数量

= 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷细胞数量

ε：对硝基苯酚的摩尔消光系数，138mol/L/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，20 min；稀释倍数：V反总÷V样=5；1000：1000mL=1L；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=1.67x-0.001，R²=0.9991

（1）按蛋白含量计算

酶活定义：45℃，pH7.4时，每毫克蛋白质1min内催化产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=（A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀释倍数×1000 ÷Cpr

= 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时，每克样品1min内催化产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（U/g 鲜重）= （A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀释倍数×1000 ÷W

                           = 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时，每10⁴个细胞1min内催化产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（U/10⁴cell）=（A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀释倍数×1000 ÷细胞数量

= 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷细胞数量

ε：对硝基苯酚的摩尔消光系数，138mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5cm；T：反应时间，20 min；稀释倍数：V反总÷V样=5；1000：1000mL=1L；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、吸光度变化应该控制在0.05~0.8之间。否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

2、样品蛋白质含量需要另外测定，可选用考马斯亮蓝法蛋白含量测定试剂盒进行测定。