DNA恒温快速扩增试剂盒（荧光型）使用说明书

（货号：WLE8202KIT）

原理概述：

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。本试剂盒在39 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。

产品特点：

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需20 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。

可适用于各种品牌的荧光定量PCR仪、恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。

引物设计：

建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

荧光探针设计：

探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：距离5’端的≥35 nt的中部位置标记一个dSpacer（，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4 nt；THF距离3’末端≥15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer。

试剂盒组成：

试剂盒储存：

运输条件：低温运输；

储存条件：储存温度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；

产品有效期：12个月。

操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

1)    每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

2)    每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

3)    向反应管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH₂O体积，至模板与ddH₂O总体积为13.5 μL）；

4)    zui后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

5)    混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温39 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信号采集通道的选择与荧光探针设计一致）荧光值；反应时间20 mins。

注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

体系配制                             正对照荧光结果图

*正对照反应单元体系配制：正对照模板加入2μL，引物与探针加入4.6 μL正对照引物探针Mix（已包含探针和上/下游引物），其他组分参照体系配制。

注意事项：

1．  由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量核酸污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有核酸污染。

2．  试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。