A液：400ul （20uM浓度：每块分离胶加入40ul；50uM浓度：每块分离胶加入100ul；）

B液：400ul （20uM浓度：每块分离胶加入40ul；50uM浓度：每块分离胶加入100ul；）

注：常规使用浓度为20uM，如过表达体系；如果目的蛋白浓度较低，则建议使用50uM或者100uM浓度。（最佳使用浓度取决于蛋白，请根据每个蛋白的具体情况摸索合适的条件）

1. 按照常规配制分离胶的配方进行配胶（配方参见附表）；

2. 在加入TEMED之前加入产品A液和B液（需要充分混匀）；

4度避光保存，12-18个月

1. 提高转膜效率

电泳后，电转之前，需要使用螯合剂（EDTA）从凝胶中除去锰离子（Mn2+）。此步骤可提高磷酸化和非磷酸化蛋白转移到PVDF膜上的转移效率。

1）电泳后，将凝胶在含有1?10mmol/L EDTA的转膜缓冲液中浸泡至少10分钟，同时轻轻摇动。（10分钟×1?3次）。

2）接下来，将凝胶在不含EDTA的转膜缓冲液中浸泡10分钟，同时轻轻摇动（10分钟×1次）。

3）强烈推荐使用湿法进行转膜，也可以使用半干法。

2. 条带弯曲

P-Tag电泳SDS-PAGE常见的问题是“条带弯曲”。需要确保样品中不含有EDTA。

1）预染的marker：由于泳道之间盐浓度的差异，marker和样品的条带均会受影响。使用预染marker常常导致条带弯曲，在含有该Marker的溶液和其他溶液之间至少需要留一条空白泳道。

2）酸性样品：条带可能弯曲。如果溶液为黄色至橙色，即使在加入上样缓冲液后，请加入Tris缓冲液直到其为中性（紫色）。

3）EDTA（Mn2+被螯合），钒酸，无机盐，表面活性剂等可引起条带弯曲或拖尾。4）空白泳道：空白泳道可能会导致条带弯曲。在空白泳道中加入等量的1x上样缓冲液。

5）钒酸：竞争结合磷酸可能导致条带弯曲。使用不同的磷酸酶抑制剂，或通过TCA沉淀或透析

6）将MnCl2添加到样品中（如终浓度1mM）可能改善结果。如果样品有EDTA残留，添加的Mn2+被螯合而不是凝胶中含有的Mn2+。