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免疫共沉淀实验
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。
免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是一种经典的生物化学技术,用于研究蛋白质之间的相互作用。其原理主要基于抗体和抗原之间的专一性结合作用。以下是对免疫共沉淀原理的详细解释:
抗体与抗原的专一性结合:免疫共沉淀利用抗体能够特异性地识别并结合其对应抗原的特性。这种专一性结合是免疫共沉淀技术的基础。
细胞裂解:首先,细胞需要在非变性条件下被裂解,以保留细胞内蛋白质之间的相互作用。这样,原本在细胞内相互结合的蛋白质在裂解后仍然保持结合状态。
抗体与靶蛋白的结合:将特异性的抗体加入到细胞裂解液中,抗体将与裂解液中的靶蛋白(即已知或待研究的蛋白质)形成抗原-抗体复合物。
复合物沉淀:如果系统中存在与靶蛋白相互作用的蛋白质(称为结合蛋白),这些结合蛋白也会与靶蛋白-抗体复合物结合,形成更大的蛋白质复合物。随后,通过离心或其他物理方法,可以将这些复合物沉淀下来。
细胞裂解:在非变性条件下裂解细胞,获取细胞裂解液。
抗体结合:在细胞裂解液中加入特异性的抗体,使抗体与靶蛋白结合形成复合物。
沉淀复合物:通过离心或其他方法将蛋白质复合物沉淀下来。
洗脱与分析:对沉淀物进行洗脱,去除非特异性结合的杂质,然后进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)及Western blotting等分析,以确定与靶蛋白相互作用的蛋白质。