脂多糖( LPS )，也称为内毒素，是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。LPS是脊椎动物先天免疫系统的强力刺激剂，可引起发烧、感染性休克和死亡。它也被认为是检测细菌病原体入侵的生物标志物，负责炎症反应和内毒素休克的发展。在生物材料，如蛋白质、多肽或抗体样品中检测LPS是生物制造和生物加工的一项重要任务。Amplite 荧光法内毒素检测试剂盒使用Endotoxin Green，一种敏感的荧光底物。Endotoxin Green在内毒素和鲎血细胞提取物( LAL )的存在下水解。Endotoxin Green的水解产物产生强烈的绿色荧光。内毒素活性与Endotoxin Green水解产生的荧光强度成正比。Amplite 荧光法内毒素检测试剂盒可检测广泛的内毒素(从1 EU / ml到0.001 EU / ml)。它是非常敏感的，可以在30分钟内检测到低至0.001 EU / mL的内毒素。

样品分析方案

概述

制备Endotoxin Green工作溶液

添加大肠杆菌内毒素标准品和测试样品（25µL）

添加鲎溶血酶溶液（25µL）

在37°C下孵育30分钟

准备并添加Endotoxin Green工作溶液（50µL）

在10分钟内读取Ex/Em=490/525 nm时的荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

1.Endotoxin Green储备液

将50µL DMSO添加到Endotoxin Green小瓶中（成分A）制成100X Endotoxin Green储备溶液。

2. 5X LAL细胞裂解液储备液

将500µL无内毒素水（组分B）加入鲎细胞裂解液（组分C）小瓶中，制成5X鲎细胞溶解液溶液。

E、 大肠杆菌内毒素标准溶液

将10µL 100 EU/mL大肠杆菌内毒素标准溶液添加到990µL无内毒素水（组分B）中，生成1 EU/mL的大肠杆菌内毒素溶液（ES1）。然后取1 EU/mL大肠杆菌内毒素标准溶液（ES1），在无内毒素水（B组分）中进行1:3的连续稀释，得到连续稀释的大肠杆菌内毒素（ES2-ES7）。

工作溶液配制

1. Endotoxin Green工作溶液

添加50µLEndotoxin Green将储备溶液溶于5mL无内毒素水（组分B）中，使总体积为5.05mL Endotoxin Green工作溶液。

2. LAL工作溶液

将500µL鲎细胞裂解液（LAL）储备溶液添加到2 mL无内毒素水（组分B）中，使总体积为2.5 mL鲎细胞溶解液（LAL）工作溶液。

注：根据需要和使用前准备LAL工作溶液的量。使用无内毒素瓶或试管。

操作步骤

表1.大肠杆菌内毒素标准品和测试样品在透明底部96孔微孔板中的布局。ES=E。大肠杆菌内毒素标准（ES1-ES7，1.00至0.001 EU/mL）；BL=空白对照；TS=试样

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和表2中提供的布局，制备大肠杆菌内毒素标准品（ES）、空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每个孔使用12.5µL试剂，而不是25µL。

2.向大肠杆菌内毒素标准品、空白对照品和测试样品的每个孔中加入25µL 2X鲎鲎裂解液。

3.充分混合并在37°C下孵育30分钟。

4.添加50µL Endotoxin Green将工作溶液添加到大肠杆菌内毒素标准品、空白对照品和测试样品的每个孔中，使总分析体积为100µL/孔。对于384孔板，添加25µL Amplite Endotoxin Green将工作溶液注入每个孔，总体积为50µL/孔。

5.检测Ex/Em=490/525nm，Cutoff:515nm的荧光强度。

注：为获得良好结果，在添加工作溶液后2至10分钟内读取。 注：可加入25µL 25%乙酸以停止反应。