YIJI植物丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase）总活性光度法定量

检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI植物丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase）总活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过特异反应系统中氧化型*腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原后峰值的增高，即采用光度法来测定植物组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等丙酮酸脱氢酶激酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase；PDK；EC2.7.11.2或EC2.7.1.99），又称为丙酮酸脱氢酶复合物激酶（pyruvate dehydrogenase complex kinase），属于*/*激酶家族成员之一，位于线粒体基质内。其功能在于调节碳水化合物代谢，控制PDH活化状态，通过可逆性磷酸化丙酮酸脱氢酶（E1）α亚体上的*残基，以达到ATP依赖性丙酮酸脱氢酶失活，降低丙酮酸氧化，增强丙酮酸转化为乳酸。PDK短期调节是由糖酵解产生的丙酮酸以及ADP等抑制其活性，而线粒体内乙酰*和NADH水平增高激活其活性。哺乳动物丙酮酸脱氢酶激酶分为4个同工酶，而植物有1至2个同工酶：玉米和水稻有2种，拟南芥有1种。其中植物PDK1主要位于叶部，在植物生长发育的整个过程中高达表达，而PDK2存在于所有组织器官，与光合作用有关。通过抑制PDK活性，可以改变植物生长表型，提高生长产率（包括种子重量或含油量增加），花期提前，周期缩短。植物同工酶具有70至77%的同源性，而与哺乳动物只有37%同源性，其结构与原核生物*激酶（histidine kinase）相同。 基于底物丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase；PDH），在ATP存在与否的情况下，受到丙酮酸脱氢酶激酶的磷酸化后，其辅酶因子氧化型*腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；β-NAD）转化为还原型*腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；β-NADH）产生变化，通过测定吸光值（340nm 波长），来定量分析丙酮酸脱氢酶激酶的总活性。其反应系统为：

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI缓冲液（Reagent C）  毫升

YIJI反应液（Reagent D）       毫升

YIJI底物液（Reagent E）       毫升

YIJI阴性液（Reagent F）    毫升

YIJI专性液（Reagent G）            微升

产品说明书      1份

保存方式

保存YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI缓冲液（Reagent C）、YIJI反应液（Reagent D）、YIJI底物液（Reagent E）和YIJI专性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反应液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

DOUNCE匀浆器：用于组织匀化

（微型）台式离心机：用于样品操作

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的YIJI裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 样品准备

• 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
• 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent E）避免光照
• YIJI缓冲液（Reagent C）在室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）

• 样品总活性测定

• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入5微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数） 

• 样品非特异活性测定

• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI专性液（Reagent G）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入5微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数（5分钟读数－0分钟读数）

• 计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

2）样品特异活性

• 酶标仪测定

1）样品总活性测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品总活性
• 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent F）或待测样品（100微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

2）样品非特异活性测定

• 在96孔板上做好相应标记：待测样品
• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI专性液（Reagent G）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E） 
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入5微升待测样品（注意：100微克蛋白）
• 轻轻摇动96孔板

• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

• 样品特异活性计算

（1）样品活性（总活性和非特异活性）

（2）样品特异活性

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 建议使用比色皿测定
• 样品须澄清，至关重要 
• 加样后3秒内光度测定
• 测定值由低到高变化；测定可持续5分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/5微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 丙酮酸脱氢酶激酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够抑制转化1微摩尔丙酮酸至乙酰*所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列丙酮酸脱氢酶通路分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感

订购信息

单组分订购信息

编号 名称 规格

YJ50777.4 YIJI植物丙酮酸脱氢酶激酶总活性光度法定量检测试剂盒 20次

YJ50777.4A YIJI清理液（Reagent A）     毫升

YJ50777.4B YIJI裂解液（Reagent B）      毫升

YJ50777.4C YIJI缓冲液（Reagent C）     毫升

YJ50777.4D YIJI底物液（Reagent D）      毫升

YJ50777.4E YIJI反应液（Reagent E）      毫升

YJ50777.4F YIJI阴性液（Reagent F） 毫升

YJ50777.4G  YIJI专性液（Reagent G） 毫升

试剂盒订购信息