上海都宜生物科技有限公司

环保在线免费8

收藏

磷酸钙法转染HEK293T细胞

时间:2012-07-27      阅读:1473

 磷酸钙法转染HEK293T细胞

 
一.试剂配制
 
无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;
 
2XHBS: 280mM NaCl
 
10mM KCl
 
1.5 mM Na2HPO4
 
12 mM glucose
 
50 mM HEPES
 
Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;
 
2M CaCl2: 过滤灭菌,分装。
 
二. 实验过程:
 
1. 铺细胞: 选择状态良好的293T细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish。
 
2. 20-24h后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染。下面就35mm dish为例,采用以下转染体系:
 
ddw: 105ul
 
plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)
 
2M CaCl2: 16.5ul
 
2XHBS: 125ul
 
按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。
 
先将前三者混匀, zui后加2XHBS。
 
一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。
 
另一种方法是, 加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。
上一篇: 新生大鼠心肌细胞培养 下一篇: 细胞划痕实验
提示

请选择您要拨打的电话: