动物淋巴管内皮细胞的分离

基本方案1：灌注消化法
实验材料：
1.  哺乳动物胸导管淋巴管
2.  1×PBS，含*100u/ml和*100μg/ml，pH7.4
3.  0.2%Ⅰ型胶原酶
4.  眼科剪，*
5.  慕丝线（7号线）、细铁丝
6.  离心管（15ml、50ml）
实验方法：
1.  处死动物后，打开胸腔，分离胸导管，在胸导管上端结扎，切取10-15cm的一段。将胸导管放入预冷PBS中漂洗。
2.  在解剖显微镜下，用眼科剪和*剥除外膜的脂肪和纤维组织，然后用PBS反复冲洗管腔。
3.  将胸导管移入含PBS的大培养皿中，清洗3次。在胸导管的远端插入*，并结扎固定。用PBS冲洗管腔后，将游离端结扎。用*向管腔内注入消化液，至淋巴管充盈为止。在37℃条件下，消化10min。淋巴管的管壁较薄，灌注消化时间不宜过长，以免消化过度，引起成纤维细胞的污染。
4.  取出胸导管，在游离端剪一小口，用离心管收集消化液，然后用培养液冲洗管腔，收集消化液和冲洗液，以1000r/min，离心10min。离心后吸去上清液，用培养液轻轻混悬细胞。
5.  将细胞接种于培养皿或培养板中，培养24h后补充培养液，继续培养。每隔2-3d换液1次。换液时，吸去1/2-2/3培养液，再加入新鲜培养液。
6.  原代培养4-6h后，大部分细胞已贴壁生长。24h后，内皮细胞形成由数个细胞组成的细胞群。淋巴管内皮细胞的活性较低，原代培养时细胞生长缓慢。2-3周后，细胞生长形成单层。淋巴管内皮单层呈卵石状特征性排列，可传代培养。
基本方案2：植块培养法
实验材料：
1.  哺乳动物胸导管或肠系膜淋巴管
2.  1%明胶铺底，置超净台晾干
3.  1×PBS，含*100u/ml和*100μg/ml，pH7.4
4.  眼科剪，*
5.  慕丝线（7号线）、细铁丝
6.  离心管（15ml、50ml）
实验方法：
1.  处死动物后，打开胸腔，分离胸导管，在胸导管上端结扎，切取10-15cm的一段。将胸导管放入预冷PBS中漂洗。
2.  在解剖显微镜下，用眼科剪和*剥除外膜的脂肪和纤维组织，然后用PBS反复冲洗3次。用*纵向切开管腔，再用PBS冲洗管腔面。然后，将管腔剪成约1mm3 的小块。
3.  将组织快放入培养皿中，使内膜面朝下，放入37℃，含5%CO2 的孵箱中培养4h。加入培养液，胸导管组织块能否贴壁是内皮细胞培养的关键。因此，加入培养液时操作要轻，以免使组织块浮起。
4.  静置培养3d后换液，以后每隔2-3d换液1次。培养4-6d后，内皮细胞开始自植块长出，细胞呈长梭形或多边形。2-3周后，细胞生长形成单层。待细胞生长形成单层时，可传代培养。