PCR产物的直接测序
时间：2012-11-21 阅读：441
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PCR产物的直接测序
1.凝胶纯化PCR扩增的靶序列
如果*PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:
1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来分离。
2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出来。
4.取少量（1-5%）进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。
5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，用丙烯酰胺电泳分离。
当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或重复序列或保守的信号序列（conserved signal sequences）的同样显子，可以通过下列两种不同方法来改进电泳分离。
1）.先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后电泳纯化完整的PCR产物。
2）.用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了解在不同PCR产物中的内切酶位点。
2.杂合体的直接测序
当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带（compound sequencing ladders）。
当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带（compound sequencing ladders）。
有四种方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:
1）.克隆分离不同 的模板
2）.在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模板
3）.在测序反应中只启动一个等位基因
4）.只扩增一个等位基因
3.测序模板的制备
与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速结合起来，从而阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物──模板复合物的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化zui终的测序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。
.双链DNA模板
.双链DNA模板
有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电泳前*行旋转透析（Spin-dialysis）纯化。
1.在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 （pH7.5）来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入测序缓冲引物。
2.在95℃下保温5分钟来变性模板，冰浴（或在干冰乙醇中）快速冷却离心管，以减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后加入都合适。
单链DNA模板
单链DNA模板
使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链分离凝胶中制备，或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段，可从琼脂糖凝胶中分离笪到，但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中使用一个*标记的引物，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分离，只有*标记的链才可结合到柱上。
然而，zui简单的方法是用改进的PCR方法，用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中（不对称PCR，asymmetric PCR），在开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当*的那个引物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现，这时*的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样呈线性积累，这时反应中仅有一个引物存在。各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言，引物比率为50pmo:0.5pmol，经过30个循环后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。
ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a）。在PCR 反应中，除了加入正常数量的dDNA外，还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光。b）.取5%的反应物来走 胶，转移到膜上，并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定 量，因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%）的扩增效率低（70%）。
在实验中，这可通过增加PCR循环的次数来弥补。若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可以试一试不同的引物比率;b）.再加5-10个PCR循环;c）.在zui后五个循环中多加Tab聚合酶（2U）;d）.试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不同产量的ssDNA。制备出的单链DNA用*的那个PCR引物或用一个内引物来测序，并应用常规方法进行掺入测序（incorporation sequencing）或标记引物测序。制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5-末端，但可能在靠近3-末端不同位点处被切去，这是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而，对于测序反应中所使用的任何一种引物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。
zui近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子，转录出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种方法的应用受到很大的限制。
4.用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序
4.用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序
一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶，修饰T7DNA聚合酶（测序酶）及反转录酶来测序。
用Taq聚合酶进行PCR产物的测序