兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体 AFP（Alpha Fetoprotein） Western Blot技术:

一、 原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝#纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类  现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用*种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体 AFP（Alpha Fetoprotein）

三、 主要试剂

、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。  2、 十二烷基硫#钠SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、 分离胶缓冲液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀释到00ml终体积。过滤后40℃保存。

4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml mol/L HCl调至pH6.8加水稀释到00ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫#铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。0%（w/v）过硫#胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.

6、 SDS- PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝.6ml，H2O 32ml混匀备用。按:或:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#电泳缓冲液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸馏水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#电极缓冲液。临用前稀释0倍。

8、 转移缓冲液：配制L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨#、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量L。

9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三#乙#30g 磺基水杨# 30g 加水至00ml 用时上述储存液稀释0倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

0、 脱脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷#缓冲盐溶液（PBS）。

2、 Tris缓冲盐溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 过氧化物酶标记的第二抗体。

5、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶于00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L  兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体 AFP（Alpha Fetoprotein）  做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），样品不能反复冻融;，加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，能多加几中种蛋白酶抑制剂。
同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测，有的甚至可以同时测几十种样品。
如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时加上NaF去抑制磷#化酶的活性。
样品的蛋白含量很低，每微升不到微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，可以加大上样量，转移时可以用减少电流延长时间，多加5-0%甲醇。
想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋白不好做
如果上样量超载，可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试.5mm的 comb。
蛋白变性后存放-80℃，一两年没有问题，zui关键两条：不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
采用DAB显色技术，二抗是化的多克隆抗体，三抗是亲和素体系，不能使用脱脂奶粉，脱脂奶粉会影响亲和素的生成，因为脱脂奶粉中含，用BSA代替应该好一点.
Western Blot一般上样30-00微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。