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金葡菌特异性鉴别基因

时间:2011-05-07      阅读:524

在金葡菌的检测方面,近年来很多学者逐渐探索了一些有很强特异性的鉴别基因,主要包括如下几种。

a.耐热核酸酶基因(heat stable nuelease,nuc)。耐热核酸酶(thermostablenuclease,TNase)是金葡菌的特异性酶,通过检测TNase酶活性以鉴定金葡菌通常有较好的专一性和准确性,但也存在一些非金葡菌株可检测到该酶活性的例子,其原因尚不清楚,可能是由于其可产生与TNase活性相似的酶。编码酶蛋白的nuc基因已全部定序。通过nuc基因的特异扩增来检测金葡菌已被证实具有非常好的特异性,避免了检测酶活时出现的假阳性现象,有很好的应用前景。扬州大学比较医学中心高正琴、邢华等通过扩增rlUC基因可以在4h内检测到zui低3pg DNA或5个金葡菌,并由此制备了特异性探针,检测灵敏度达lpg DNA,符合率为100%。

b.staphopainA/B。saphopains是一种与葡萄球菌致病性相关的、外分泌型半*蛋白水解酶,包括蛋白水解酶A和蛋白水解酶B两种,分别由基因scpA和sspB编码。GolonkaE等通过PCR-RFLP技术对126株临床分离金葡菌进行了研究,发现所有菌株均检测到这两种基因的存在,且分别分为四型和六型。Southern杂交试验表明scpA和sspB基因在各菌株间高度保守,说明saphopains应该属于持家基因产物且具有重要的致病性能。

c.血浆凝固酶(eoagulase)基因。大多数致病性葡萄球菌产生此酶,而非致病性菌一般不产生,因此,该酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。凝固酶有两种:一种是分泌至菌体外的蛋白质称为游离凝固酶(free coagulase);另一种结合于菌体表面并不释放,称为结合凝固酶(boundcoagulase)或凝聚因子(clumping factor)。游离凝固酶采用试管法检测,结合凝固酶则以玻片法测定。凝固酶耐热,粗制品加热至100~C经30rain或高压灭菌后仍保持部分活性(staphylococcusbacteriaintroduce);凝固酶基因曾被认为是鉴定金葡菌的特异性基因,但后来发现有少数金葡菌并不产生凝固酶,且一些凝固酶阴性菌也有很强的致病性,且因具有过高的多态性而更多地应用于金葡菌的分子分型技术。

d.16SDNA、23SDNA及间隔序列23SRNA和168RNA分别为构成核糖体大、小亚基的重要组分,它们的基因即23SDNA和16SDNA在分类学的种间有高度的保守性,常可用来作为特异序列鉴定菌种属。J.丸Straub等以23S DNA为靶基因,通过PCR技术检测了肉类产品发酵剂及乳制品中的S.aulelgs,通过选择性前增菌过程,可在大量杂菌存在的背景下于12h内检测到10CFU浓度的目的菌,进而通过嵌套PCR技术可使检测极限下降一个数量级;翟俊辉等建立了以细菌16SDNA为对象的基因芯片技术,在4.5h内的纯细菌培养液中能检测到235个菌体的金葡菌;同时,一种通过对168rDNA扩增引物3’端单碱基错配来鉴定S.aUreUS的策略也具有很好的效果。rRNA杂交试验在检测金葡菌时表现出良好的特异性,但对临床样品的检测中缺乏很好的灵敏性而限制了它的应用。

e.转录调控基因。D·Liu等报道了对S.aureus中编码转录调控因子的基因进行分析,发现了两个特异性片段Sa0836和Sa0856,并分别设计相应引物进行PCR,结果表明该序列对S.aureus具有明显的特异性,可检测所有待测的23株金葡菌,而其他类型葡萄球菌及常见菌均无此基因,表明该基因有很好的鉴别特异性。

f.Sma I限制性酶切片段特异序列。一段44kb的Sma I序列被证实为金葡菌特异性序列。J.Stepan等将13株不同类型的金葡菌菌株基因组的EcoR工酶切片段与Sma工序列杂交,发现了在所有菌株中均存在一段2052bp的特异序列,通过设计引物,在待测的216株金葡菌中均特异性扩增出826bp片段,而其他阴性对照菌均无该特异片段。

g.基因组特异性插入片段。Francis Martineau等在广泛分析了金葡菌基因组文库后得到一段442bp的、编码未知功能的特异性插入片段,通过PCR扩增在所有待测82株金葡菌中,均表现出特异性结果,而在其他类型葡萄球菌及非葡萄球菌致病菌中均未扩增,特异性强,操作简便,耗时短(仅1h)。

 

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