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实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类,探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加,非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA、RNA样品进行定量(包括定量和相对定量)和定性分析。
主要服务:DNA或RNA的定量分析、基因表达差异分析、基因分型。
主要技术:引物设计、RNA提取、cDNA合成、qPCR。
参数规格:
产品名称:植物内源基因18SrDNAPCR检测试剂盒
产品货号:CP100224
产品规格:48T 0.1PCR管/48T 0.2PCR管
产品分类:PCR-荧光探针法
产品运输:低温运输
产品保存:-20℃保存
产品有效期:一年
产品特点:本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。
PCR反应鉴定——PCR反应条件:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | 30-40 |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | 30-40 |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
实验过程:
一、试剂准备
1. DNA模板
2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
实验注意事项:
1)RT-PCR可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料,不同的样本有不同要求,实验前请充分沟通确认实验方案和样本情况;
2)客户尽可能提供实验的背景信息、物种、基因准确的名称和ID号;
3)客户尽量不要提供DNA或RNA样品。
4)样本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中。
使用方法:
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意:DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA,后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线(以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体病毒做阳性对照,只提供没有传染性的、可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水(用带芯枪头,下同)。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL(注:请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL,建议每次稀释10倍,梯度稀释至10E7拷贝/μL)。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头,从6号管中取5 μL溶液到5号管中,充分震荡1分钟,得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头,从5号管中取5 μL溶液到4号管中,重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR(见下步),每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值,并以之为纵轴,以浓度的对数值为横轴,绘制标准曲线。
短乳杆菌DNA聚合酶γ抗体Human MNX1(Motor neuron and pancreas homeobox protein 1) ELISA Kit人超敏热休克蛋白60(HSP-60)免疫试剂盒
大肠埃希氏菌死亡受体5抗体Human OTX2(Homeobox protein OTX2) ELISA Kit人超敏前列腺特异性抗原(PSA-U S)免疫试剂盒
麦氏游动微菌桥粒芯糖蛋白4抗体Human PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform) ELISA Kit人超敏C反应蛋白(hs-CRP)免疫试剂盒
*蜜粘褶菌=革裥菌自然杀伤激活受体相关蛋白DAP12抗体Human S1PR1(Sphingosine 1-phosphate receptor 1) ELISA Kit人超磷酸化微管相关蛋白tau(hyper phosphorylated MAPT)免疫试剂盒
黑曲霉自然杀伤激活受体相关蛋白DAP12抗体Human PIK3CD(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit delta isoform) ELISA Kit人肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)免疫试剂盒
泡盛曲霉无精症缺失基因4抗体Human GPX2(Glutathione peroxidase 2) ELISA Kit人肠三叶因子(ITF)免疫试剂盒
核侧耳多能发育相关基因4抗体Human AMELX(Amelogenin, X isoform) ELISA Kit人肠道病71型(EV71)抗体(IgM)免疫试剂盒
真姬菇锌指蛋白DZIP1抗体Human APEH(Acylamino-acid-releasing enzyme) ELISA Kit人层粘连蛋白亚基γ-2(LAMC2)免疫试剂盒
三叶草根瘤菌Notch信号通路Delta样配体1抗体Human STAB1(Stabilin-1) ELISA Kit人层粘连蛋白β1(LN-β1)免疫试剂盒
侧孢短芽孢杆菌同源转录因子DLX1抗体Human SLC31A1(High affinity copper uptake protein 1) ELISA Kit人层粘连蛋白-5(LN-5)免疫试剂盒
短芽孢杆菌Hsp90辅助伴侣分子CDC37抗体Human AGMAT(Agmatinase, mitochondrial) ELISA Kit人层连蛋白/板层素(LN)免疫试剂盒
双孢蘑菇肌营养不良蛋白抗体Human AKR1C1(Aldo-keto reductase family 1 member C1) ELISA Kit人布鲁氏菌抗体IgG(Brucella Ab IgG)免疫试剂盒
枯草芽孢杆菌金属离子转运体1抗体Human ACLY(ATP-citRate synthase) ELISA Kit人布卢姆综合征蛋白(BLM)免疫试剂盒
红色红曲抑癌蛋白DKK1抗体Human YRDC (YrdC domain-containing protein, mitochondrial) ELISA KIT人不对称二甲基(ADMA)免疫试剂盒
大肠埃希菌膜转运蛋白DISPA抗体Human ITIH5L(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H5-like protein) ELISA Kit人补体因子I(CFI)免疫试剂盒
黄叉曲霉DIRAS2蛋白抗体Human EFNA1(Ephrin-A1) ELISA Kit人补体因子H相关蛋白1(CFHR1)免疫试剂盒
植物内源基因18SrDNAPCR检测试剂盒果生假丝酵母Candida│carpophila 质量规格:>99%,BRGAD/IA2自身抗体elisa试剂盒灰毡毛忍冬皂苷甲
戊糖乳杆菌Lactobacillus│pentosus 质量规格:>99%,BRG1/S特异性周期蛋白E1试剂盒海藻糖
黄色赤杆菌Erythrobacter│flavus 质量规格:>70%,BSF-肌动蛋白试剂盒红-龙胆二糖苷
宽松环单顶孢Monacrosporium│lysipagum 质量规格:BSFOS 样抗原2试剂盒决明素
猪布鲁氏菌Brucella│suis 质量规格:>98%,BRFMS样激酶3配体试剂盒红景天素
暗球腔菌Phaeosphaeria│sp. 质量规格:>98%,分子生物学级FMS样激酶3试剂盒
大肠埃希菌Escherichia│coli 质量规格:>98%,BRFc受体样蛋白3试剂盒黑芥子硫苷酸一水
嗜酸菌Acidiphilium│sp. 质量规格:>98%,BRFAM172A蛋白试剂盒黄腐酚
球孢白僵菌Beauveria│bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. 质量规格:>98%,BRE选择素试剂盒华蟾它灵