荧光标记

　　荧光修饰可以通过共价键的形式连接在多肽序列的N端或C端，但是更推荐在N端进行修饰。以下为合生生物常用荧光修饰以及发光颜色。

    

　　多肽荧光标记结合成像技术后可用于识别特定靶点。共聚焦或荧光显微镜的体外成像仍然是研究细胞内各种生物过程和相互作用十分有效的方法之一。与蛋白质不同，这些肽定位于肌动蛋白上的特定靶点，不易聚集蛋白质，因此非常适合于体外跟踪。同样，FITC标记的CPP也可被用于细胞内组分的成像，且其细胞毒性低。

　　其中，FITC是一种胺活性的荧光染料，可广泛的用于标记多肽和蛋白质。合生生物在N端标记Fitc，都会建议在后面一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入烷基间隔器（alkyl spacer）如AJYS（Ahx）。链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有后面一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如AJYS，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。空间位阻被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因，而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。

　　下图是合生生物多肽荧光标记经典案例之一：

　　合成FITC-Ahx-RAKWNNTLKQIASK的MS&HPLC图谱

　　对于较长的序列，建议使用FRET pairs(fluorescence resonance energy transfer pairs)进行修饰。

　　荧光共振能量转移（FRET）是描述两个荧光团之间的能量转移的机制。由于FRET效率部分基于供体和受体分子之间的距离，因此该技术通常用于研究酶效率，蛋白质-蛋白质相互作用或其他分子动力学。

　　图1.蛋白酶研究的FRET机制。

　　(当肽保持完整时，受体分子将淬灭供体分子，并且不会检测到荧光。如果序列被蛋白酶活性切割，则受体将不再淬灭供体，并且将检测到荧光信号)

　　FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具，由于其反应过程可被连续监测，为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。

　　供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽是完整的，表现出的是内部的荧光猝灭，但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光，此荧光可被连续检测，从而可对酶的活性进行定量分析。

　　FRET肽可作为各类酶研究的合适底物，比如：

　　1.肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的动力特征和功能特征。

　　2.对新的蛋白水解酶的筛选和检测。

　　3.对多肽折叠的构象研究。