Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（荧光法）红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NAD/NADH的试剂盒，烟*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

这种Amplite 荧光NAD / NADH比率分析试剂盒为敏感检测NAD，NADH及其比例提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了来自生物样品的干扰。 无需从样品混合物中纯化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可以通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（大Ex / Em = 540/590nm）或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。 该试剂盒提供NAD和NADH提取缓冲液，以及细胞裂解缓冲液，方便您使用。 它经常用于从细胞裂解物中测定NAD / NADH。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（荧光法）。

实验方案

96孔板测定示例

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室温下孵育15分钟

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反应混合物

在室温下孵育15分钟至2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：

3.1将30μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入970μLPBS缓冲液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL30M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：3连续稀释，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品添加到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1.实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADH提取溶液中和。

表2每个孔的试剂组成

*注意：将连续稀释的NADH标准品从0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>300μM，终浓度）可能由于NADH传感器（非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

3.4对于NADH提取（NADH）：将25μLNADH提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNAD提取溶液（组分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

对于NAD提取（NAD）：将25μLNAD提取溶液（组分E）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH提取溶液（组分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

对于总NAD和NADH：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。 在室温下孵育10至15分钟，然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液（组分F）。

注意1：根据需要准备细胞或组织样本。 NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

注意2：在健康的哺乳动物细胞中，与NADH相比，NAD更多，因此可以简单地使用总NAD和NADH减去NAD来计算NADH的量。

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将75μLNADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.4）的每个孔中，使得总NADH测定体积为150μL/孔。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。