腺苷3'，5'环状单磷酸酯（cAMP）是细胞内信号转导的重要第二信使。监测cAMP水平是筛选GPCR激动剂和拮抗剂的zui常用方法之一。Screen Quest™比色ELISA cAMP分析试剂盒基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下，HRP-cAMP共轭物仅与抗cAMP抗体结合。但是，测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体，因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest™比色ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种灵敏的方法，用于在生化或基于细胞的分析系统中检测腺苷酸环化酶的活性。与其他ELISA cAMP分析试剂盒相比，我们的试剂盒省去了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite™Green作为比色底物来定量HRP活性。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行。

1. 准备样品
2. 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP涂层的96孔板中
3. 在室温下孵育5-10分钟
4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP共轭物
5. 在室温下孵育3小时
6. 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
7. 添加100 µL /孔的Amplite™Green
8. 在室温下孵育1至3个小时
9. 监测405、650或740 nm处的吸光度增加

重要说明
请勿冻结Anti-cAMP Ab预包被的96孔板（组分F），将其保存在4°C下。在使用之前，将所有套件组件加热至室温。在运输过程中，某些材料可能会粘在小瓶盖上。短暂离心小瓶以收集所有内容物。

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免重复冻融循环。

1. cAMP储备溶液（100 µM）：
将1 mL测定缓冲液（组分B）加入小瓶cAMP标准液（组分A）。

：2. HRP-cAMP的缀合物原液（50X）
加入55μL（目录号36370。或550μL（）目录号36371。测定缓冲液（成分B）的）到HRP-cAMP的结合物（成分C）的小瓶中。注意：未使用的50X HRP-cAMP共轭原液应分为一次性使用的等分试样，并在-20 ^o C下保存。

3.洗涤液（1X）：
将1 mL的10X洗涤液（组分D）添加到9 mL蒸馏水中。

配制标准溶液

为了方便起见，请使用我们的系列稀释计

在测定缓冲液（组分B）中按1：10、1：100和1：3的比例连续稀释cAMP标准品，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP稀释溶液。存放在冰上或4°C下。

准备工作溶液

HRP-cAMP偶联物工作液：
使用前，用测定缓冲液（组分B）以1:50稀释，以得到1X HRP-cAMP偶联物工作液。存放在冰或4°C下。注意： 25 µL 1X HRP-cAMP共轭物工作溶液足以用于一个测定点；准备适当的体积，仅供一次性使用。

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程序

准备样品

1. 根据需要处理细胞：
   以下是用Forskolin处理以96孔板形式诱导cAMP的Hela细胞的示例：吸出细胞生长培养基，在Hanks中加入100 µL /孔100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS） ），在5％CO ₂和37°C的培养箱中孵育15分钟。孵育后吸出细胞溶液，加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液（组分E），然后在室温下孵育另外10分钟。该细胞裂解液可以直接测定，也可以在测定缓冲液（组分B）中稀释后测定。注意：应单独评估每个细胞系，以确定*细胞密度。取决于细胞类型和/或测试化合物的作用，可以在实验的前一天或实验当天将细胞接种。
    
2. 组织样品：
   由于组织中环状核苷酸的快速代谢，收集后迅速冷冻组织（例如使用液氮）非常重要。称重冷冻的组织，并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰上均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
    
3. 尿液，血浆和培养基样品：
   尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1：200至1：1000的稀释度进行测试。培养基也可以在裂解缓冲液中以1:10至1：200的稀释度进行测试。注意： RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

cAMP分析

1. 所有测定孔均按以下顺序准备：A）cAMP标准品，对照或测试样品；B）HRP-cAMP共轭物。
    
2. 将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（组分F）的每个孔中。我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
    
3. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP共轭工作溶液。将板放在摇床上，在室温下孵育3小时。
    
4. 吸出板内容物，并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
    
5. 在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite™Green（组分G），并在避光的条件下在室温下孵育60分钟至3小时。
    
6. 使用吸光度板读数器监测405 nm，650 nm或740 nm处的吸光度增加。

   36370	Screen Quest™cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*	Screen Quest™ Colorimetric ELISA cAMP Assay Kit	1 plate
   36371	Screen Quest™cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*	Screen Quest™ Colorimetric ELISA cAMP Assay Kit	10 plates
   36373	Screen Quest™cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*	Screen Quest™ Fluorimetric ELISA cAMP Assay Kit	1 plate
   36374	Screen Quest™cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*	Screen Quest™ Fluorimetric ELISA cAMP Assay Kit	10 plates
   36379	Screen Quest™免洗cAMP检测试剂盒*荧光能量共振转移法*	Screen Quest™ FRET No Wash cAMP Assay Kit	1 plate
   36380	Screen Quest™免洗cAMP检测试剂盒*荧光能量共振转移法*	Screen Quest™ FRET No Wash cAMP Assay Kit	10 plates
   36381	Screen Quest™免洗cAMP检测试剂盒*荧光能量共振转移法*	Screen Quest™ FRET No Wash cAMP Assay Kit	50 plates