产品信息

产品简介

      MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS 采用磷酯酰si氨酸（PS）亲和 Tim４蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用 10,000×g 离心后的上清。该试剂盒使用含有 EDTA 的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他 EVs 可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。

◆膜表面磷酯酰si氨酸（PS）亲和法

Tim４蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰si氨酸（PS），然后使用含有 EDTA 的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡。

◆优点・特色

使用新型亲和提取方法

 无需进行超滤
●　使用磁珠改进了操作
●　流程优化
※　高重复性   

样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。

●　可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡

●　可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

●　重复性高，回收量稳定

●　简易操作（约3.5小时）

●　启用多个样品（无需超速离心）

◆试剂盒组成

*每套试剂盒能完成５次回收实验，即实际使用量为 10×5次/Kit 与 2×5次/Kit

◆案例•应用

从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析

从人血清中提取外泌体的产量比较

使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用 CD9 和 CD63 抗体进行免疫印迹实验。

●　检测抗体

      抗 CD9 兔多抗，System Bioscience公司

      抗 CD63 兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果相当于 150 μL 的血清样本。从 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 样品缓冲液，全部上样。

从人EDTA血浆中提取外泌体

分别从１mL 的 EDTA 血浆、EDTA 血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行 WB 检测（抗 Flotillin2 抗体）。

●　检测抗体

      抗 Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience 公司

●　使用样品量

      各１mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应 150 μL 样品量。从 100 μL 提取物中取出 15 μL，添加５μL的 4×SDS 样品缓冲液，全部上样。

从人尿液中提取外泌体的回收量比较

１mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗 CD9 抗体）。

●　检测抗体

   抗 CD9 兔多抗，System Biosciences 公司

●　使用样品量

   各１mL

●　免疫印迹（WB）数据

   各样品结果分别对应 150 μL 尿液样品。从 100 μL 提取物中取出 15 μL，加入５μL的 4×SDS 样品缓冲液，全部上样。

◆与传统沉淀法的功能比较实验

分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS【PS 亲和法】

按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1 mL经过离心处理（10,000×g，30min）的 K562 细胞培养上清（无血清培养基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基※1）中提取外泌体。

超速离心法

将 10 mL 经过离心处理（10,000×g，30 min）的 K562 细胞培养上清（无血清培养基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70 min），用 TBS 缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

从 1 mL 经过离心处理（10,000×g，30 min）的 K562 细胞培养上清（无血清培养基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。

※1：110,000×g 离心２小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果

分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用 NanoSight LM10 检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为２%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（２~4×10¹⁰ particles），在透射电子显微镜进行分析。

电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ 可提取到很多 100 nm 左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

K562 细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）

用 PS 亲和法、超离法和聚合物沉淀法从 K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和 WB 法（CD63, Flotilin-2 和 Lamp-1 抗体）进行实验。

回收量，不是回收率

●　检测抗体

     抗 CD63 小鼠单抗（MEM-259）

     抗 Flotillin-2 小鼠单抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司

     抗 Lamp-1 小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience 公司

K562 细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10% FBS-添加培养基）

用 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从 K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS 补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和 WB 法（CD63、Lamp-1 和 Flotilin-2 抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自 K562 细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。

●　检测抗体

     抗 CD63 小鼠单抗（MEM-259）

     抗 Flotillin-2 小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience 公司

     抗 Lamp-1 小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience 公司

     健康人血清来源的外泌体中提取 miRNA 和 mRNA 的回收量比较

实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的 microRNA 和 mRNA 的回收量

通过超离法和 PS 亲和法将 EVs 从正常人血清中分离，然后使用 microRNA 提取试剂盒（产品编号295-71701）提取 RNA。通过 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比较 microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。

相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。 

②运用不同的 RNA 提取方法提取 microRNA 和 mRNA 的回收量比较

运用 PS 亲和法将 EVs 从正常人血清中分离，然后使用 microRNA 提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于 AGPC 法的试剂提取 RNA。通过 qRT-PCR 分析提取的 RNA，并比较microRNA（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）、mRNA（GAPDH, PIK3CB）的 Ct 值。

◆外泌体蛋白质组学分析 

<实验内容及结果>

分别利用 PS 亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含 10% FBS（不含外泌体）的 K562 细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用 10% 聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用 LC-MS 对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过 MASS 分析鉴定的qian 10 个蛋白质

白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱：来自 FBS 的牛蛋白污染物

红 色：来自外囊泡的标记蛋白

样品：K562 细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）

成对组合相关性比较

◆应用数据

Protein Assay BCA Kit 检测外泌体的蛋白质浓度

Protein Assay BCA Kit 是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中zuiyongyong的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质 Cu²⁺ 离子被还原为 Cu⁺。Cu⁺与 BCA 形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定 562 nm 处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过 Protein Assay BCA Kit 高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。

【实验内容及结果】

将通过 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的 25 μL 外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit 中试剂Ａ和试剂Ｂ混合液 200 μL。之后 60℃ 孵育 30 分钟，检测 560 nm 吸光度（图1）。结果表明，通过 Protein Assay BCA Kit 的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此 BCA 测定时不要稀释样品。

①　将 BSA 标准溶液按照 250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL 和空白对照，分别每孔 25 μL 加到 96 孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔 25 μL 加入 96 孔板。

③    把 200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂Ａ盒试剂Ｂ混合液（Ａ：Ｂ=50：1）加入放有样品的孔板中。

④    60℃ 孵育 30 分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定 560 nm 的吸光度

◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验

【实验概要】

用 PKH67（Sigma公司）标记 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela 细胞导入确认。

<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从 K562 细胞培养上清液提取外泌体）。

2. 用 BCA Assay 和 NanoSight 检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度。

3. 将相当于5 μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5 mL管中。

   *请配制合适的使用量。

4. 将 2.0 μL 的 PKH linker 溶解在 0.25 mL 的 DiluentC 中。…4×Dye solution*

   *请配制合适的使用量。

5. 添加1/3样品量的 4×Dye solution 至样品中，混合后在室温中孵育 5-10 分钟。

6. 根据附带的操作说明用 PBS 平衡 Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo 公司）。

7. 将 100 μL 样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100 μL）。

   *准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好 Hela 细胞的培养皿中，24 小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

   *根据实验调节外泌体添加量

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察

从 16 mL K562 培养上清液中超滤浓缩得到４mL 培养上清液作为样品，通过 PS 亲和法提取外泌体。

●　提取的外泌体蛋白质浓度：22.3 ng/μL

●　粒子浓度：1.2×10⁸ particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的 Hela 细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。

Opti-MEM：取相同量用 PKH 标记后添加到细胞中作为阴性对照。

◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作

样品预处理：对样品进行 1,200×g 离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行 10,000×g 离心操作※2。

下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。

更换缓冲液（限制过滤）操作

用 50 mL TBS 缓冲液对１mL 已经经过离心处理的 EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把 19 mL TBS 加进 VivaSpin20（100K）中。

2. 把 １mL 离心过的 EDTA 血浆上清添加在第１. 的VivaSpin20（100K）中，混匀。

3. 把第２. 的VivaSpin20（100K）在４℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 缓冲液。

5. ４℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后，在 VivaSpin20（100K）中追加 10 mL TBS 缓冲液。

7. ４℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后，在 VivaSpin20（100K）中追加 11 mL TBS 缓冲液。

9. ４℃下离心处理直至样品液量达到１mL 以下。

10. 进行提取。

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤

◆产品列表

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